非小細胞肺癌組織p-mTOR、p70s6k、PTEN蛋白的表達變化及其意義

許浩然，何世杰，張秀義，景衛革，孫亞東，王嘉

(1承德市中心醫院，河北承德067000 ；2河北醫科大學第一醫院)

肺癌居我國惡性腫瘤發病率和病死率的首位，非小細胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型。癌基因活化、抑癌基因失活可導致細胞周期調節失控，細胞增殖異常[1]。腫瘤組織中常存在磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的過度活化。mTOR可加快細胞周期轉化、抑制細胞凋亡、促進腫瘤轉移。磷酸化的mTOR(p-mTOR)是該通路活化的生物學標志[2]。核糖體40 S小亞基S6蛋白激酶(p70s6k)是p-mTOR下游直接作用底物，被p-mTOR磷酸化的p70s6k可促進細胞內生成核糖體、起始因子及延伸因子，促進腫瘤細胞的浸潤、轉移。第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(PTEN)是抑癌基因，可抑制PI3K及Akt對mTOR的激活，使細胞周期停滯，誘導細胞凋亡，抑制腫瘤的浸潤、轉移。本研究觀察了NSCLC組織中p-mTOR、p70s6及PTEN的表達變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月～2016年3月間在我院收治的NSCLC患者82例，其中男64例、女18例，年齡43～75(61.28±9.13)歲；組織學類型為鱗狀細胞癌42例，腺癌40例；高分化癌50例，低中分化癌32例；無淋巴結轉移52例，淋巴結轉移30例。均行腫瘤切除術，術前未進行放、化療治療，術中留取癌組織標本(肺癌組)。另選擇取自肺癌同側遠端肺泡組織標本46例份為肺泡組，正常支氣管黏膜標本50例份為支氣管組。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 兔抗人PTEN、p70s6k及p-mTOR單克隆抗體購自美國santa cruz公司，免疫組織化學試劑盒及DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 PTEN、p70s6k及p-mTOR檢測方法 采用SP免疫組織化學法。應用檸檬酸緩沖液修復，經濃縮型DAB試劑顯色，蘇木素復染。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。以已知受檢蛋白的陽性病理切片作陽性對照，以PBS液代替一抗作陰性對照。結果判定由兩位病理科醫師采用雙盲法分別觀察處理后切片，如出現結果判定不一致時，由第三名高年資病理科醫師做最后結果判定。p-mTOR在正常肺泡細胞及支氣管黏膜上皮細胞質內不顯色或呈淡灰黃色，為陰性或弱陽性表達，在NSCLC胞質呈金棕黃色，為強陽性表達。PTEN在正常肺泡細胞及支氣管黏膜上皮胞質呈金棕黃色，為強陽性表達，在NSCLC胞質不顯色或呈淡灰黃色，為陰性或弱陽性表達。PTEN在正常肺泡細胞及支氣管黏膜上皮胞質呈金棕黃色，為強陽性表達，在NSCLC胞質不顯色或呈淡灰黃色，為陰性或弱陽性表達。以陽性細胞數占所觀察細胞總數百分比及染色強度綜合計算，陽性細胞數占所觀察細胞總數百分比：<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分；染色強度：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每張病理切片隨機選取5個400倍視野，二者相加，≤3分判定為陰性，>3分判定為陽性。

2 結果

肺癌組、肺泡組、支氣管組p-mTOR陽性表達率分別為68.29%(56/82)、17.39%(8/46)、32.0%(16/50)，肺癌組p-mTOR陽性表達率明顯高于其余兩組(P均<0.05)。p-mTOR在肺鱗癌、肺腺癌者陽性表達率分別為71.43%(30/42)、65.0%(26/40)，肺鱗癌、肺腺癌者p-mTOR陽性表達率均高于其余兩組(P均<0.05)。

肺癌組、肺泡組、支氣管組 p70s6k陽性表達率分別為85.37%(70/82)、21.74%(10/46)、32.0%(16/50)，肺癌組p70s6k陽性表達率明顯高于其余兩組(P均<0.05)。p70s6k在肺鱗癌、肺腺癌者的陽性表達率分別為95.24%(40/42)、87.5%(35/40)，肺鱗癌、肺腺癌者p70s6k陽性表達率均高于其余兩組(P均<0.05)。

肺癌組、肺泡組、支氣管組PTEN陽性表達率分別為34.15%(28/82)、71.74%(33/46)、72.0%(36/50)，肺癌組PTEN陽性表達率明顯低于其余兩組(P均<0.05)。PTEN在肺鱗癌、肺腺癌者的陽性表達率分別為33.33%(14/42)、35.0%(14/40)，肺鱗癌、肺腺癌者PTEN陽性表達率均低于其余兩組(P均<0.05)。

p-mTOR、p70s6k及PTEN表達與NSCLC臨床病理參數的關系見表1。p-mTOR表達與NSCLC腫瘤分化程度、臨床分期有關(P均<0.05)，PTEN表達與NSCLC腫瘤分化程度、淋巴結轉移、臨床分期有關(P均<0.05)。

表1 p-mTOR、p70s6k及PTEN表達與NSCLC臨床病理參數的關系(例)

相關性分析結果顯示，NSCLC組織PTEN與p-mTOR、p70s6k陽性表達均呈負相關(r=-0.38, -0.478；P均<0.01)；p-mTOR、p70s6k陽性表達呈正相關(r=0.311,P<0.01)。

3 討論

mTOR參與細胞周期檢查點調整、蛋白質翻譯起始控制及細胞凋亡調整，可加快細胞周期轉化、減少細胞凋亡、促進腫瘤浸潤、遷移。子宮內膜癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肺癌組織中均發現mTOR表達異常升高，其發生與mTOR信號通路過度活化有關。p-mTOR能磷酸化下游靶蛋白，其表達水平能敏感反映mTOR通路的活化狀態。研究[3]顯示p-mTOR在正常細胞中表達陰性或低水平表達，在惡性腫瘤中呈異常高水平表達，提示p-mTOR能促進腫瘤發生、發展及轉移，抑制腫瘤凋亡，與腫瘤臨床病理特征具有一定相關性。

p70s6k是p-mTOR下游直接作用底物，其活性升高引起蛋白質合成的加速，從而促進腫瘤的生成。p-mTOR能磷酸化p70s6k，磷酸化狀態的p70s6k活性較其前體活性大大增強[3]。p70s6k與消化系統腫瘤、卵巢癌、乳腺癌、血管瘤及腮腺腺癌等腫瘤密切相關。

具有磷酸酶活性的抑癌基因PTEN是PI3K/Akt/mTOR信號通路的“總開關”，其脂質磷酸酶是其發揮抑癌作用的關鍵，其功能失活可解除其對腫瘤信號傳導通路的抑制作用，直接參與腫瘤的發生[4]。PI3K特異性磷酸化細胞膜的磷脂酰肌醇，生成PIP2、PIP3，其中PIP3在PI3K/Akt/mTOR通路中起信使作用。PTEN蛋白使PIP3去磷酸化形成PIP2，喪失信使功能，阻斷信號通路，最終誘導細胞凋亡，抑制腫瘤浸潤、轉移，起負性調節作用。研究[5]顯示PTEN基因缺失可刺激PI3K基因超表達，增強通路活性，降低對凋亡信號敏感性，促進腫瘤增殖、轉移。

本研究收集NSCLCL標本為鱗狀細胞癌和腺癌，是肺癌的常見病理類型，多數發生于支氣管黏膜上皮細胞，少部分發生于肺泡上皮細胞，故設立支氣管和肺泡正常對照組以提高實驗可靠性。

p-mTOR在乳腺癌、前列腺癌及肝細胞癌中表達增高[6]， 發現肺癌中mTOR基因明顯擴增，其蛋白陽性表達明顯高于良性病變組織，且表達水平隨腫瘤臨床分期增加而升高，提示mTOR與肺癌發展有密切關系。Baba等[7]研究發現p70s6k高表達是肝細胞癌預后不良的獨立危險因素，p70s6k過表達能促進卵巢癌血管生成及腫瘤細胞轉移。雷帕霉素抑制大腸癌細胞增殖并下調雷帕霉素敏感株的p70s6k表達水平，提示p70s6k除可以表明通路處于異常活化狀態，還可以作為雷帕霉素抑制腫瘤細胞的敏感指標。本研究發現，NSCLCL組織中存在p-mTOR、p70s6k高表達，提示NSCLC中存在p-mTOR/p70s6k信號通路過度激活。分別檢測鱗癌及腺癌組織中兩種蛋白表達水平，均顯著高于對照組，提示p-mTOR和p70s6k在鱗癌和腺癌發病過程中存在相似的促癌機制。本研究結果顯示與非肺癌病變相比，肺癌中PTEN蛋白表達水平顯著下降，提示PTEN缺失、突變及失表達促進NSCLC發生、發展。

研究[8，9]發現，p-mTOR表達與胃癌及食管癌的分化程度有關，本研究中，p-mTOR表達與腫瘤分化程度相關，高分化癌中表達水平低，隨癌組織向低分化發展，腫瘤細胞惡性傾向越明顯，p-mTOR表達水平越高，提示其促進了NSCLC惡性化趨勢。Herberger對NSCLC患者隨訪顯示p-mTOR陽性患者生存期比p-mTOR陰性患者生存期明顯縮短，本研究結果也發現，早期肺癌患者組織中p-mTOR蛋白表達較低，腫瘤分期越晚，p-mTOR蛋白表達水平越高，患者預后越差，對判斷NSCLC患者預后有重要意義。

本研究結果顯示，p70s6k表達水平與年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、組織學類型及淋巴結轉移等臨床病理特征均無關。但p70s6k在NSCLC中高表達，反映了mTOR通路活性在癌組織中發生異常升高，預示NSCLC患者應用雷帕霉素治療可能取得更好療效，有助于選擇患者接受 mTOR抑制劑治療。研究[10～12]顯示在肺癌、食管癌、胰腺癌中mTOR和p70s6k蛋白表達呈正相關。本研究結果也證實了這一結論，提示兩指標通過同一通路發揮協同促癌作用。

本研究中PTEN表達與腫瘤分化程度及臨床分期相關，在低分化及晚期癌組織中明顯降低，與以往研究結果大致相同[13]。腫瘤分化越差，PTEN表達越低，其機制可能為PTEN缺失解除了對mTOR通路的抑制作用，通路活性增強，使細胞呈現無節制生長，PTEN蛋白丟失越多，細胞分化程度越差，腫瘤惡性程度越高。PTEN低表達促進肺癌浸潤及轉移，其陰性的肺癌患者容易出現淋巴結轉移。PTEN隨臨床分期升高而降低，提示其表達缺失呈加重趨勢，完全失活多出現在晚期，此時腫瘤更具侵襲性和轉移能力，顯示PTEN缺失預示著肺癌更具侵襲性而預后較差，是NSCLC發展過程的晚期事件，可作為判斷病人預后的生物學指標[14]。

本研究中PTEN與p-mTOR、PTEN與p70s6k表達水平分別呈負相關，說明PTEN缺失導致mTOR信號系統的過度激活[15]，p-mTOR與p70s6k表達呈正相關，提示二者在NSCLC演變過程中起協同促癌作用。

綜上所述，NSCLC存在p-mTOR、p70s6k高表達及PTEN低表達，p-mTOR、p70s6k可能協同促進 NSCLC的發生發展，PTEN可能在 NSCLC的發生發展中起抑制作用。

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