腹腔注射趨化因子受體2抑制劑RS102895、色甘酸鈉對小鼠間質性膀胱炎的預防觀察

王鑫朋，孫二琳，張東正，趙坤，劉春雨，劉利維

(1 滄州市中心醫院，河北滄州061001；2 天津醫科大學第二醫院)

間質性膀胱炎(IC)是指在膀胱鏡下具有典型的膀胱點狀出血、膀胱壁 Hunner 潰瘍及相關組織學特征的一種疾病[1]。IC的主要的病理生理變化為肥大細胞在膀胱黏膜下層及膀胱肌層的活化和聚集[2]。多數學者[3]認為IC的發病機制是“肥大細胞假說”，但其具體發生機制目前尚不明確。肥大細胞被激活后脫顆粒可釋放組胺、5-羥色胺、類胰蛋白酶等多種活性物質。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)又稱單核細胞趨化和激活因子，屬于C-C亞族(β亞族)成員，起初是從人髓樣單核細胞系THP-1、神經膠質瘤細胞系以及脂多糖(LPS)或PHA刺激的人外周血單個核細胞培養上清中發現。研究[4]發現，MCP-1對單核細胞和嗜堿粒細胞有趨化作用，能使嗜堿粒細胞和肥大細胞脫顆粒。趨化因子受體2(CCR2)是肥大細胞表面MCP-1受體，MCP-1可與CCR2發生特異性結合[5]。研究[6]發現，IC患者尿液和膀胱組織中MCP-1的水平和表達均升高，但具體機制尚不明確。2016年6月～2017年1月，我們觀察了腹腔注射CCR2抑制劑RS102895、肥大細胞穩定劑色甘酸鈉對小鼠IC的預防作用。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、實驗動物、試劑及儀器 趨化因子受體CCR-2抑制劑RS102895購自Tocris公司，肥大細胞穩定劑色甘酸鈉購自美國Sigma公司。4～6周齡BALB/c雌性小鼠36只，體質量17～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，LPS購自美國Sigma公司，硫酸魚精蛋白(PS)購自美國Sigma公司，MCP-1 ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司，組胺ELISA試劑盒購自Abvona公司，酶標儀購自美國BioTek公司。

1.2 小鼠分組、給藥方法 36只雌性BALB/c小鼠采用隨機數字表法分為A、B、C、D組，每組9只。A、B、C組制作小鼠IC模型：0.06 mL/10 g的劑量腹腔注射5%水合氯醛麻醉，麻醉滿意后排空膀胱，繼續膀胱灌注50 g/L PS(約0.1 mL)，在膀胱內保留45 min，再次排空膀胱，生理鹽水沖洗3次，灌注750 μg/mL的 LPS溶液并保留30 min，再次排空膀胱；每隔7天灌注1次，共灌注3次。A組首次膀胱灌注后1.5 h即按照5 mg/kg腹腔注射RS102895，1次/d,共注射21 d；B組首次膀胱灌注前2天即開始腹腔內注射色甘酸鈉溶液50 mg/kg，1次/d,共注射23 d；C組每日注射等體積PBS溶液，共注射21 d。D組為空白對照。首次膀胱灌注記為第1 d第5 d使用反射排尿法收集各組小鼠尿液；第22 d拉頸處死各組小鼠，10%甲醛固定膀胱標本，備用。

1.3 炎癥指標觀察方法

1.3.1 各組膀胱組織黏膜和固有層炎性變化觀察 取各組膀胱組織，常規石蠟包埋，切片，隨機選取5張切片行HE染色。顯微鏡下觀察膀胱組織黏膜和固有層炎性變化。

1.3.2 各組膀胱固有層及逼尿肌中肥大細胞、脫顆粒細胞觀察 取各組膀胱組織，石蠟包埋后切片，行甲苯胺藍染色。隨機選取甲苯胺藍染色后的切片中的10個高倍視野，測算各組鏡下肥大細胞數、脫顆粒細胞百分比。

1.3.3 各組尿液MCP-1、組胺水平檢測 收集各組尿液，2 h內分別用MCP-1、組胺ELISA試劑盒檢測尿液MCP-1、組胺，所有操作及樣本準備均嚴格按照使用說明書進行。用酶標儀在450 nm 波長處測量其光密度值 (OD值)；根據標準品OD值繪制標準曲線，測算各組尿液MCP-1、組胺含量。

2 結果

2.1 各組膀胱組織炎性變化 C組膀胱炎性反應最重，可見大量炎性細胞浸潤，膀胱黏膜上皮剝脫并可見組織水腫、充血；A、B組炎性反應較輕，膀胱上皮相對完整；D組未見炎性細胞浸潤，膀胱上皮完整，見圖1。

2.2 各組膀胱固有層及逼尿肌中肥大細胞計數、脫顆粒細胞百分比比較 各組膀胱固有層及逼尿肌中肥大細胞計數、脫顆粒細胞百分比比較見表1。

2.3 各組尿液MCP-1、組胺比較 各組尿液MCP-1、組胺含量比較見表2。

3 討論

圖1 各組小鼠膀胱組織炎性變化(200×)

組別肥大細胞計數(個)脫顆粒肥大細胞百分比(%)A組3.44±1.24*#34.39±4.98*#B組2.78±1.39*#44.73±7.02*#C組16.33±3.57*83.96±6.56*D組1.44±0.8817.28±3.17

注：與D組比較，＊P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

表2 各組尿液MCP-1、組胺含量比較

注：與D組比較，＊P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

IC的發病機制目前尚不明確，女性發病率高于男性，癥狀反復發作、診斷困難及治療效果不佳是目前IC的治療難點。目前臨床主要以對癥治療為主[5]。肥大細胞作為一種重要的炎性細胞在各種生理病理過程中都發揮著重要作用，如過敏性哮喘、慢性胃炎、組織的損傷和修復等。IC的一個主要的病理生理學變化即為肥大細胞在膀胱黏膜下層及肌層的活化和聚集。眾所周知，肥大細胞可以被激活后脫顆粒釋放多種活性物質，如組胺、5-羥色胺、類胰蛋白酶、前列腺素、白三烯、血小板活化因子和細胞因子等[7]，常見的誘發肥大細胞激活的因素有細菌、病毒的某些成分、干擾素等。有研究[8]表明大腸埃希菌屬的LPS 可以誘導肥大細胞產生腫瘤壞死因子、IL-6、IL-13、組胺等。

MCP-1可引起肥大細胞的聚集和激活，而且可以被單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞及某些腫瘤細胞等多種細胞分泌。MCP-1與CCR2發生特異性的結合，此受體主要分布于單核細胞、髓樣前體細胞系和嗜堿性粒細胞中，屬于IL-8R家族[3]。MCP-1通過與相應受體結合激活細胞內的信號傳導通路， MCP-1活化的信號傳導路徑因細胞的類型而不同，而路徑的差別又可導致細胞趨化活性的不同。MCP-1通過與相應的受體結合后發揮多種生物學功能。有學者[9]在IC的動物模型中發現，IC大鼠的膀胱和尿液中MCP-1蛋白明顯增多，肥大細胞表面MCP-1受體CCR2表達增加，并認為CCR2受體可能成為一個潛在的IC治療靶點。本研究發現，A組小鼠膀胱組織炎性反應較輕，膀胱上皮相對完整。

色甘酸鈉作為一種肥大細胞穩定劑被偶然發現。它是一種色酮類化合物[10]，對平滑肌無直接松弛作用，對炎性介質亦無拮抗作用，主要作用在于抑制抗原抗體結合后過敏性介質的釋放。色甘酸鈉的藥理學機制主要是通過與肥大細胞膜上的鈣離子通道結合，這樣Ca2+的內流受到抑制，從而使MCP-1、組胺、白三烯等多種炎性因子釋放減少[11]。研究[12]發現，色甘酸鈉可以抑制大鼠肥大細胞脫顆粒釋放炎性因子。盡管色甘酸鈉的治療效果在患者中有差異性，而且在哮喘的治療中只是起到輔助作用，但是還在諸如肥大細胞增多癥、過敏性結膜炎等疾病中有著不錯的治療效果。

雖然目前不能完全解釋肥大細胞為什么會在IC患者的膀胱中聚集、增殖以及活化脫顆粒，一種可能的解釋是損傷的尿路上皮細胞或者其他膀胱內的細胞分泌趨化因子如MCP-1。這些趨化因子進一步導致肥大的遷移以及活化。我們前期研究發現在環磷酰胺小鼠膀胱炎癥模型中，MCP-1在尿路上皮、固有層以及平滑肌表達升高，驗證了MCP-1對于肥大細胞的趨化作用，并且驗證了其對于肥大細胞的激活。本研究中，A組阻斷CCR2受體后，尿中組胺、MCP-1的含量較對照組明顯下降，因此我們推斷，在尿路上皮出現損傷后，釋放大量的活性因子，結果引起肥大細胞的聚集和活化，脫顆粒釋放更多的細胞因子和炎性因子。這些炎性介質進一步引起肥大細胞的聚集和加重膀胱組織的損傷，從而形成惡性循環。而且在使用肥大細胞穩定劑色甘酸鈉治療IC小鼠后，有效緩解小鼠膀胱的炎癥水平。

綜上所述，RS102895、色甘酸鈉均可減輕IC模型小鼠的炎癥反應，其作用機制可能與MCP-1通過與肥大細胞結合、促進組胺釋放有關 。但其具體作用機制仍需進一步研究。

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