表沒食子兒茶素沒食子酸酯對乙肝病毒復制的體外抑制作用及其機制

吳紹鳳，鄭榮榮，司鳳磊，劉宏博，郭文聰，李寧，侯琳

(1青島大學基礎醫學院，山東青島266021；2青島大學附屬醫院)

乙型肝炎病毒(HBV)感染可引起急、慢性肝炎和重型肝炎，我國是HBV感染大國。目前臨床上主要采用 α 干擾素 (IFN-α)和核苷類似物進行抗病毒治療[1]，核苷類藥物的耐藥性和 IFN-α 的無應答一直是當前抗病毒治療的局限所在。尋找干預 HBV 感染和復制的新靶點和新方法，最大限度的抑制 HBV 復制，對阻止乙肝進程及并發癥的發生具有重要意義。綠茶的主要功能成分是茶多酚，以黃烷醇和黃酮醇為主。兒茶素是綠茶中黃酮類的主要成分，其中以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)含量最多[2]。研究[3]表明EGCG具有抗腫瘤細胞增殖、抗細胞氧化、誘導細胞凋亡、抗菌等作用，且具有神經保護作用。最新研究[4]發現，EGCG還具有抗病毒活性,如能抗流感病毒、HIV病毒、EB病毒、腺病毒等。EGCG在體外可抑制乙肝病毒復制[5]，但其具體作用機制卻鮮有報道。2016年10月～2017年7月，我們以HepG2.2.15細胞為模型，觀察了EGCG對HBV復制的體外抑制作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、EGCG、試劑及儀器 HepG2.2.15細胞系購自iCell生物公司。HepG2.2.15細胞給予含15%胎牛血清(Gibco公司)的MEM(Gibco公司)培養基，置于5%的CO2、37 ℃飽和濕度的培養箱中培養。EGCG(南通飛宇生物科技有限公司)，根據我們前期細胞毒性實驗結果，80 μmol/L以下EGCG對HepG2.2.15細胞的細胞毒性較小，因此，我們選擇40、80 μmol/L進行后續實驗。

0.02%胰蛋白酶消化液(碧云天生物有限公司)；MTT試劑盒(索萊寶生物公司)；青鏈霉素混合液(碧云天生物有限公司)；反轉錄試劑盒(Takara公司)；實時定量PCR試劑盒(北京全式金生物有限公司)；HBV抗原檢測ELISA試劑盒(上?？迫A生物工程股份有限公司)；自噬抑制劑(氯喹CQ、3-MA、Rapamycin)和兔抗LC3多克隆抗體(Sigma公司)；鼠抗β-actin、p62多克隆抗體(SantaCruz公司)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司)；BCA蛋白試劑盒和Protein marker(ThermoFisher公司)；6xProtein loading buffer(北京全式金生物有限公司)。垂直電泳儀、濕法轉膜儀(Bio-Rad公司)；牛血清白蛋白(BSA)(索萊寶生物有限公司)。

1.2 EGCG對乙肝病毒抗原、DNA的影響觀察

1.2.1 HepG2.2.15細胞分組及EGCG干預方法 取對數生長期HepG2.2.15細胞接種于12孔板，將細胞分為樣本(A、B組)及對照組，每組5個復孔。A組、B組分別加入終濃度為40和80 μmol/L的EGCG，對照組不做任何處理。

1.2.2 各組乙肝病毒抗原檢測 培養24 h后收集細胞上清，用PBS稀釋10倍，按照ELISA試劑盒說明書進行乙肝病毒e抗原和s抗原的檢測。分別置于酶標儀490、630 nm波長處檢測各孔的光密度OD值，按照公式計算乙肝病毒e抗原和s抗原的相對表達量?？乖鄬α?[樣本(OD490-OD630)/空白(OD490-OD630)]×100%。

1.2.3 各組乙肝病毒DNA檢測 采用real-time PCR法。培養24 h后收集細胞上清，用Takara公司的迷你病毒DNA提取試劑盒提取上清中病毒DNA。用預冷的PBS洗兩遍，裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，PH 7.4，1 mmol/LEDTA，1%NP-40)4 ℃旋轉裂解15 min，14 000 g離心1 min，取上清，再用細胞DNA提取試劑盒按說明書提取細胞質中乙肝病毒DNA，將提取好的病毒DNA進行熒光定量PCR[6]。細胞總RNA的提取，將同組細胞按照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，取1 μg總DNA反轉錄為cDNA，對內參基因GAPDH進行real-time PCR相對定量。熒光定量PCR反應條件為94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環數。熒光定量PCR的引物序列為乙肝病毒上游引物序列5′-TCTCTGCAATGTCAACGACC-3′,下游引物5′-CAGACCAATTTATGCCTACAGC -3′；GAPDH上游引物序列5′-GGAGCCAAAAGGGTCATCATCT -3′,下游引物5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTCT-3′。細胞內、細胞外乙肝病毒DNA的相對表達量以2-ΔΔCt表示。

1.3 EGCG對自噬標記蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、自噬降解相關蛋白p62/β-actin的影響觀察 采用Western blotting法。取對數生長期HepG2.2.15細胞接種于6 cm培養皿中，將細胞分為1、2、3、4。1、2組分別加入終濃度為40和80 μmol/L的EGCG，C組加入200 nmol/L的Rapamycin，4組不做任何處理。培養24 h收集各組細胞，BCA法測蛋白濃度。20 μg上樣，SDS-PAGE電泳，濕轉法轉膜，BSA室溫封閉2 h，加入p62、β-actin、LC3一抗(p62 1∶500；β-actin 1∶1 000；LC3 1∶2 500)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，10 min/次，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，ECL發光液顯色，放入成像系統顯影并拍照。對自噬標記蛋白LC3和p62以及內參蛋白β-actin的條帶進行掃描， 凝膠圖象分析各條帶的光密度值。自噬標記蛋白LC3有兩個條帶：游離形式的 LC3-Ⅰ和膜結合形式的LC3-Ⅰ，常將LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ條帶的光密度比值LC3-Ⅱ/Ⅰ作為自噬發生的指標，其比值越大代表自噬越強；p62與β-actin條帶的光密度比值p62/β-actin作為自噬降解的指標，其比值越小代表自噬越強。

1.4 抑制自噬后EGCG對乙肝病毒乙肝病毒抗原、DNA的影響觀察 取對數生長期HepG2.2.15細胞接種于12孔板，將細胞分為空白組、對照組、自噬抑制組(又分為3-MA組和CQ組)。其中，對照組、3-MA組、CQ組又各自分為2組。對照組分別加入終濃度為40和80 μmol/L的EGCG處理。3-MA組和CQ組分別先用終濃度為10 mmol/L的3-MA和50 μmol/L的CQ預處理3 h抑制自噬后，再分別加入終濃度為40和80 μmol/L的EGCG。空白組不作任何處理。培養24 h收集細胞上清，檢測各組乙肝病毒e抗原、s抗原和乙肝病毒DNA。方法同“1.2”。

2 結果

2.1 EGCG對乙肝病毒e抗原、s抗原的影響比較 見表1。

表1 培養24 h時A、B組e抗原、s抗原的相對量

注：與對照組比較，#P<0.01。

2.2 EGCG對乙肝病毒DNA的影響比較 見表2。

表2 A、B組細胞內、外乙肝病毒DNA的相對表達量

注：與對照組比較，#P<0.01。

2.3 EGCG對自噬標記蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、自噬降解相關蛋白p62/β-actin的影響比較 見表3。

表3 各組細胞p62/β-actin、LC3-Ⅱ/Ⅰ相對表達量比較

注：與4組比較，#P<0.01；與1組比較，＊P<0.01。

2.4 抑制自噬后 EGCG對乙肝病毒e抗原、s抗原及DNA的影響 見表4。

3 討論

表4 抑制自噬后各組乙肝病毒e抗原、s抗原相對量及DNA相對表達量比較

注：與對照組同濃度比較，#P<0.05。

EGCG由于其抗癌、抗氧化、抗菌、抗病毒等優點，研究[4～6]發現，在恒河猴腎細胞中，EGCG可干擾病毒黏附從而抑制輪狀病毒和腸病毒；EGCG可通過與病毒的表面蛋白相互作用抑制單純皰疹病毒黏附到硫酸乙酰肝素，發揮直接破壞作用,使病毒失活。此外，研究[7]表明，EGCG對肝炎病毒也有抑制作用，包括HCV和HBV。多項研究[8]表明，EGCG可阻止HCV進入細胞，但對病毒復制、RNA合成和病毒顆粒分泌無影響。目前，EGCG對HBV的作用研究較少。本研究表明EGCG能有效抑制HBV復制，降低e抗原和表面抗原的分泌，抑制HBV DNA的表達，且其抑制率與藥物濃度成量效關系。

自噬是真核生物進化過程中高度保守的一類降解途徑，通過形成雙層膜的自噬體，將蛋白質等生物大分子或細胞器(線粒體等)回收至溶酶體將其降解為氨基酸、單糖等小分子，實現循環再利用[9～11]。自噬的具體過程包括：起始、延伸、膜閉合、成熟和細胞內容物的降解。自噬體的膜延長需要兩類泛素結合蛋白：ATG12- ATG5-ATG16L1復合物和LC3蛋白[12]。LC3存在于哺乳動物細胞中，與酵母的自噬基因Atg8同源，它有游離形式的LC3-Ⅰ和膜結合形式的LC3-Ⅱ兩種形式。LC3單體的C端剪切加工后產生LC3-Ⅰ，而后與磷脂酰乙醇胺結合脂化，形成LC3-Ⅱ，被整合到自噬體的內外膜上，外膜上的LC3在自噬體與溶酶體融合后脫落，因此LC3常作為檢測自噬的指標。另外，p62蛋白是監測自噬水平的另一指標，一方面它靶向泛素化的細胞器和一些異常蛋白，另一方面它與自噬體內膜的LC3蛋白相互作用，將這些異常細胞器和蛋白包裹進自噬體最終送至溶酶體降解，同時p62也一并被降解，它是自噬降解的特征性底物，其累積量與自噬水平相反。研究發現，細胞受到致病微生物感染時，自噬起到一定的防御作用[13～15]。Lee等[16，17]以人神經母細胞瘤SH-SY5Y為研究對象，發現EGCG可通過誘導Sirt1激活自噬對人朊蛋白誘導的神經細胞毒性發揮保護性作用。此外，EGCG在原發性滲出性淋巴瘤細胞中可抑制人皰疹病毒的復制，并誘導凋亡和自噬的產生[18，19]。Zhong等[20]研究發現，EGCG能夠通過增強溶酶體酸性加強自噬從而抑制乙肝病毒的復制。因此，誘導肝細胞自噬可能成為治療乙肝病毒感染的一種潛在途徑。我們的研究發現EGCG能夠激活HepG2.2.15細胞的自噬通量，使LC3Ⅱ/Ⅰ的表達增加，p62蛋白的表達降低，以上這些結果與Zhong等[20]研究一致，我們推測EGCG可能通過激活自噬發揮抗乙肝病毒作用。

為進一步探討EGCG抑制乙肝病毒復制的機制，我們將EGCG分別與自噬抑制劑3-MA和氯喹聯合處理HepG2.2.15細胞再檢測其對乙肝病毒復制的抑制作用。3-MA主要通過作用于PI3KC-Ⅲ來干擾自噬的啟始過程[21～23]。氯喹則是通過干擾溶酶體酸化來抑制自噬通量膜轉運和底物降解[24，25]。研究發現，EGCG聯用自噬抑制劑干預后，HepG2.2.15細胞外的HBV DNA的水平較EGCG單處理組明顯升高，HBV表面抗原和e抗原的分泌也均有明顯升高，但相比于空白組仍有降低，說明EGCG對HBV復制的抑制作用明顯減弱，且該抑制作用部分依賴于自噬途徑，同時也說明EGCG可能還通過其他途徑抑制HBV復制，EGCG還通過哪些機制抑制HBV以及如何引發細胞自噬發揮抗乙肝病毒作用，仍需進一步探討。

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