紅色毛癬菌、犬小孢子菌生物被膜模型構建及其對特比萘芬敏感性觀察

林浩琪，劉雪萍，鄭銀麗，沈志濱，江濤，唐春萍,2

(1廣東藥科大學中藥學院，廣州510006；2 廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術研究中心；3 廣東藥科大學實驗動物中心)

自然界95%的微生物能形成生物被膜[1]。皮膚癬菌是一種侵襲人或者動物角質層的真菌，包括毛癬菌屬、小孢子菌屬和絮狀表皮菌屬[2,3]。皮膚癬菌生物被膜[4]是皮膚癬菌菌體細胞被自身產生的細胞外基質包裹后所形成的聚合物，可導致皮膚癬菌耐藥。真菌種類[5]、基質、 碳源、 酸堿環境和其他條件因素等[6]均可影響真菌生物被膜的形成。目前，關于真菌生物被膜的研究主要集中在白色念珠菌，而皮膚癬菌生物被膜形成的研究較少[7,8]。白色念珠菌屬假絲酵母菌，皮膚癬菌屬絲狀真菌，兩者生物學特性不同，且不同菌種之間孢子初黏附的時間與能力不同[8,9]。例如白色念珠菌成熟生物被膜的形成時間一般是24～48 h[9]、而紅色毛癬菌成熟生物被膜的形成時間一般是72～96 h[7]。本研究以紅色毛癬菌和犬小孢子菌為研究對象，構建體外生物被膜模型，觀察其對特比萘芬(TERB)的敏感性。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株、試劑與儀器 紅色毛癬菌標準株CMCC(F)T1d；犬小孢子菌標準株CMCC(F)M3h, 近平滑念珠菌ATCC-22019均購于中國醫學科學院皮膚病研究所(南京)，前期研究發現，紅色毛癬菌和犬小孢子菌生物被膜生長最適培養基為含胎牛血清培養基，初黏附時間分別為6、3 h。燕麥培養基依據文獻配制[10]；含胎牛血清1640培養基依據文獻配制[11]。噻唑藍(MTT)廣州瑞舒生物科技有限公司；XTT 鈉鹽(XTT)SIGMA-ALDRICH公司;鹽酸特比萘芬(TBF)美侖生物，批號：0726A； PB-10臺式數顯 PH 計(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；BA310正置顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司)；AE2000倒置顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司)。iMark酶標儀 (美國BIO-RAD公司)；DHP-9032B電熱恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；E-1010離子濺射儀 (日本株式會社日立高新科技那珂事業所)；S-3400N掃描電鏡 (日本株式會社日立高新科技 那珂事業所)；CHA-S恒溫振蕩器 (江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.2 紅色毛癬菌、犬小孢子菌體外生物被膜模型構建及其生長情況觀察 取紅色毛癬菌、犬小孢子菌標準菌分別接種于OCA和PDA培養基上，置于溫箱培養中培養兩代得到實驗菌株，然后加入無菌PBS，用血細胞計數板計數，用胎牛培養基將菌懸液濃度調至適當濃度，備用。將紅色毛癬菌和犬小孢子菌的菌液(1×106CFU/mL)分別接種到孔板中，分別在35 ℃溫箱中靜置孵育6、3 h(前期的研究結果表明紅色毛癬菌、犬小孢子菌生物被膜生長最適條件是在含胎牛血清的培養基中，初黏附時間分別為6、3 h)，棄培養基，0.01 mmol/L PBS沖洗2次，加入適量培養基，制作紅色毛癬菌、犬小孢子菌體外生物被膜模型。分別于培養24、48、72、96 h時取出培養的紅色毛癬菌生物被膜模型；于培養24、48、72、96 h時取出犬小孢子菌生物被膜模型，在倒置顯微鏡下用400倍觀察不同時間段生物被膜的生長狀況。加入100 μL XTT/menadione 溶液，35 ℃避光培養2 h。用酶標儀測定紅色毛癬菌和犬小孢子菌的光密度OD490值。不同時間點的光密度值即代表不同時間點被膜中孢子相的代謝程度，也就是生物被膜的生長狀況。

1.3 紅色毛癬菌和犬小孢子菌成熟生物被膜中細胞外基質(ECM)檢測及形態觀察 培養96 h時取紅色毛癬菌生物被膜模型，培養72 h時取犬小孢子菌生物被膜模型，棄培養基，室溫干燥，分別加入50 μL的番紅精溶液，反應5 min 后，棄去染液，加入PBS溶液沖洗直至上清液無色，分別在酶標儀上測定紅色毛癬菌和犬小孢子菌的OD492值。以OD492值代表紅色毛癬菌和犬小孢子菌成熟生物被膜中ECM的相對表達量。培養96 h時取紅色毛癬菌生物被膜模型，將爬片標本取出，于預冷2.5%的戊二醛溶液中避光固定4～6 h，用PBS浸洗 2 次，梯度乙醇( 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)進行脫水，每次10 min，過夜干燥鍍金，使用掃描電鏡觀察紅色毛癬菌成熟生物被膜的形態。

1.4 紅色毛癬菌和犬小孢子菌生物被膜對特比萘芬(TERB)的敏感性觀察 參照文獻[12]比較紅色毛癬菌、犬小孢子菌生物被膜對TERB的敏感性。

1.4.1 TERB對于紅色毛癬菌和犬小孢子菌浮游菌最低抑菌濃度的測定 分別將100 μL 用普通培養基稀釋的紅色毛癬菌和犬小孢子菌菌液(2×104CFU/mL)接種于96孔板中，分為10組，每組5個復孔，分別加入100 μL終濃度為8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 6 μg/mL的TERB，并設未加藥的對照組，35 ℃培養96 h后取出，肉眼觀察無菌生長的濃度即為MIC。用近平滑念珠菌ATCC22019作為質控菌株，氟康唑作為質控菌的藥物，氟康唑對近平滑念珠菌ATCC22019的MIC為2 μg/mL，符合CLSI質控要求。實驗重復3次，取平均值。

1.4.2 TERB抑制紅色毛癬菌、犬小孢子菌50%和80%生物被膜濃度的測定 培養96 h時取紅色毛癬菌成熟生物被膜模型；培養72 h時取犬小孢子菌生物被膜模型，棄去培養基，分為10組，每組5個復孔。分別加入100 μL終濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL的TERB，并設未加藥的對照組，繼續在35 ℃溫箱中培養48 h后，0.01 mmol/L PBS沖洗以除去藥液本身顏色對光密度值的影響；加入100 μL XTT/menadione 溶液，35 ℃避光培養2 h。用酶標儀測定OD490值。以OD490值代表TERB對于紅色毛癬菌和犬小孢子菌生物被膜的SMIC。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 紅色毛癬菌和犬小孢子菌生物被膜生長情況 不同培養時間紅色毛癬菌和犬小孢子菌生物被膜形態比較見圖1。培養48 h時兩種菌株酵母相細胞與其延伸所形成的菌絲開始密集交織,培養72 h時兩種菌株開始大量形成ECM并沿著菌絲形成團塊聚集，可見多層膜狀結構，表明兩種皮膚癬菌體外生物被膜構建成功。

注：紅色毛癬菌：(a)培養24 h；(b)培養48 h；(c)培養72 h；(d)培養96 h 犬小孢子菌:(e)培養24 h；(f)培養48 h；(g)培養72 h;(h)培養96 h。

圖1紅色毛癬菌、犬小孢子菌生物被膜形態(400×)

不同培養時間紅色毛癬菌和犬小孢子菌的OD490值比較見表1。紅色毛癬菌和犬小孢子菌形成成熟生物被膜的時間分別為96 、72 h。

表1 不同培養時間紅色毛癬菌和犬小孢子菌的OD492值比較

注：與同培養時間犬小孢子菌比較，*P<0.05。

2.2 紅色毛癬菌、犬小孢子菌成熟生物被膜OD492值比較

鏡下可見紅色毛癬菌和犬小孢子菌成熟生物被膜OD492值分別為1.925±0.111和1.173±0.157。

紅色毛癬菌成熟生物被膜菌絲相互纏繞連接，形成精密的被膜網，菌絲外圍清晰可見細胞外基質，見圖2。

2.3 TERB對紅色毛癬菌和犬小孢子菌的MIC及SMIC50、SMIC80比較 TERB對紅色毛癬菌和犬小孢子菌浮游菌MIC分別是0.125、1 μg/mL，而TERB對于紅色毛癬菌和犬小孢子菌成熟生物被膜的SMIC50、SMIC80值均大于256 μg/mL。

3 討論

注：a為掃描電鏡下紅色毛癬菌成熟生物被膜形態，b、c、d箭頭所指為紅色毛癬菌成熟生物被膜ECM。

圖2紅色毛癬菌成熟生物被膜形態

由于生物被膜本身結構的復雜性以及對真菌生物被膜的研究較少，因此目前臨床上對真菌引起相關疾病仍缺少高效的治療藥物[13]。一般情況下，成熟的生物被膜能夠產生大量的細胞外基質，其組成成分很復雜，通常包括多糖、蛋白質、核酸等，其中多糖為生物被膜的主要成分[14]。目前對真菌生物被膜的研究主要集中在白色念珠菌上，但由于皮膚癬菌和白色念珠菌之間的生物學特性存在著較大的差異，由此研究皮膚癬菌生物被膜的特性對于后期篩選具有抗皮膚癬菌活性及抗耐藥性藥物具有重要的意義。

文獻[6]報道須癬毛癬菌生物被膜的成熟時間為72 h；白色念珠菌生物被膜的成熟時間為24～48 h[9]。本文用XTT法、倒置顯微鏡法探究紅色毛癬菌、犬小孢子菌生物被膜的生長動態，結果表明，紅色毛癬菌和犬小孢子菌生物被膜的指數生長期都在48～72 h，而其生物被膜完全成熟的時間分別是96、72 h。因此，生物被膜成熟時間因菌株不同而不同，可能的原因是不同菌種之間孢子初黏附的時間與能力不同，也可能是由于不同菌種之間生態差異和所含酶不同[8]。

文獻[5,7,15]報道，番紅精能夠對ECM中含量最高的有機多糖進行染色，不同的菌種之間生物被膜的生成總量與ECM的生成量呈正相關。本研究采用了番紅精染色法分別對成熟期兩種菌株進行染色，結果顯示紅色毛癬菌、犬小孢子菌均能產生較多有機多糖，即產生較多的ECM。本研究中，在掃描電鏡下觀察到紅色毛癬菌能在聚苯乙烯材料的表面形成成熟的生物被膜，成熟期的生物被膜菌絲之間相互交錯，結合緊密，同時在某些區域上能觀察到內嵌著菌絲的ECM。

按照M38-A2方案，測定氟康唑對質控菌近平滑念珠菌的MIC結果在參考范圍內。本研究中測得TERB對紅色毛癬菌和犬小孢子菌浮游菌的MIC分別為0.125、1 μg/mL。接著探究TERB對形成產生成熟的生物被膜菌株的敏感性，結果顯示其SMIC50和SMIC80均>256 μg/mL。成熟的生物被膜對抗菌藥物的敏感性降低，降低的倍數往往是幾十倍甚至是幾百上千倍[16,17]。本研究結果發現，紅色毛癬菌、犬小孢子菌均能生成成熟生物被膜，TERB對紅色毛癬菌和犬小孢子菌的成熟生物被膜敏感性低，說明皮膚癬菌對TERB的耐藥性大大的增強，這也能從側面證明了本文已經成功的構建了皮膚癬菌的生物被膜體外模型。

本文通過研究毛癬菌屬和小孢子菌屬體外生物被膜的構建方法和生物學特性，為進行抗皮膚癬菌藥物的篩選、療效的評價和皮膚癬菌生物被膜的耐藥性提供了實驗依據。

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