Tandab(CD3/CD19)與CD19+、CD3+血液病細胞結合力及對PBMC的CD19+血液病細胞殺傷力觀察

魏中琴，張曉龍，楊圓圓，盧楊，林芳珍，張硯君

(中國醫學科學院北京協和醫學院血液病醫院，天津300020)

化學療法、放射療法或兩者聯用是腫瘤治療的傳統方法，但治療腫瘤的效果不佳。抗體治療是一種新興的腫瘤治療方法，可有效提高治療效果，且毒副作用小。但傳統的單克隆抗體無法有效募集T細胞至腫瘤部位，從而影響治療效果。隨著分子生物學和基因工程的發展，一些能募集T細胞的雙特異性抗體(BsAbs)的出現解決了這一問題[1]。目前已被美國FDA批準用于前B細胞急性淋巴母細胞白血病(B-ALL)的雙特異性T細胞銜接子(BiTE)[2，3]是這一領域最有前景的BsAbs。但BsAbs半衰期很短，治療時需長時間給藥。Kipriyanov等首次設計了一種對CD3和CD19都具有兩個結合位點的串聯四價雙特異性抗體(Tandab)，分子量為105 kDa(約為BiTE的兩倍), 在體內不容易被腎臟清除；且在體內具有良好的穩定性。體內研究[4]表明，Tandab在靜脈注入小鼠體內后的半衰期為18.4～22.9 h。我們觀察了Tandab(CD3/CD19)與CD19+、CD3+血液病細胞結合力及其對外周血單個核細胞(PBMC)的CD19+血液病細胞殺傷力的影響。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 抗體、細胞、及試劑 Alexa Fluor 488標記的鼠源性抗His-tag單克隆抗體購自MBL公司；PE標記抗CD3單克隆抗體(HIT3a)及FITC標記抗CD19單克隆抗體(HIT19a)購自中國醫學科學院血液學研究所科技公司。人B細胞淋巴瘤細胞系Raji、BJAB、Daudi(CD19+)，人急性T淋巴細胞白血病細胞系Jurkat(CD3+)及人慢性髓系白血病細胞系K562(CD19-和CD3-雙陰性)由本室保存；人胚腎293T細胞由中國醫學科學院血液學研究所國家重點實驗室程濤教授饋贈。載體pAYZ-CD3CD19由本室構建并保存；載體pGL3-Control (Promega)由本室保存；慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP由中國醫學科學院血液學研究所國家重點實驗室馬曉彤教授饋贈，是慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP去掉CMV啟動子后得到的pCDH-MCS-EF1-copGFP(pLentiR-EV)，表達載體中含有編碼綠色熒光蛋白的基因，便于在轉染時觀察轉染效率。正常人外周血由天津市血液中心提供；Taq DNA聚合酶購自上海申能博彩生物公司；Pyrobest DNA聚合酶購自TAKARA公司；T4 DNA連接酶購自北京全式金生物技術有限公司；ECL蛋白免疫印跡底物液(A和B)、BCA蛋白定量試劑盒，購自美國Pierce公司；RPMI-1640培養基、DMEM培養基、胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司；質粒小量提取試劑盒、無內毒素質粒大提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；DNA片段膠回收試劑盒購自大連寶生物TAKARA公司；超濾管購于美國Milipore公司；HisTrap excel蛋白純化柱購自美國GE公司；His-Tag ELISA檢測試劑盒購自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2 慢病毒表達載體pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)的構建、純化及鑒定 采用PCR、overlap PCR、酶切、連接等方法構建慢病毒表達載體pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)。以pAYZ-CD3CD19為模板,將CD3VL-CD19VH和CD19VL-CD3VH序列擴增，將兩個單鏈抗體的可變區通過不同長度的G4S序列連接在一起并克隆進載體中，同時在多肽鏈的羰基端引入6個His標簽，得到編碼Tandab(CD3/CD19)的基因片段，多肽鏈表達后會以首尾相連的形式形成同源二聚體。克隆入pGL3-Control載體，將SV40啟動子、目的基因、PolyA片段和SV40增強子克隆到pCDH-MCS-EF1-copGFP中，得到表達載體pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)。將Lipofectamine 2000與稀釋后的pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)混合，均勻加入293T細胞培養液中混勻，使pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)瞬時轉染293T細胞。48 h后收集上清，離心去除細胞殘渣。根據HisTrap Excel(1 mL)親和鎳柱的操作說明對攜帶His標簽的目的蛋白Tandab(CD3/CD19)于AKTA Primer純化系統中進行純化。BCA蛋白分析法測得 Tandab(CD3/CD19)的抗體濃縮后可達20 μg/mL。將樣品(分為兩組，其中一組加入終濃度為2%的巰基乙醇)與上樣緩沖液混勻，煮沸10 min。12%SDS-PAGE后考馬斯亮藍染色，轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入小鼠抗His 標簽單克隆抗體4 ℃孵育過夜，用PBST洗滌3次，每次10 min。將NC膜與用脫脂奶封閉液稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠IgG抗體(1∶5 000稀釋)密封在塑料袋中，置于搖床中于室溫孵育2 h。用PBST洗滌3次，每次10 min，于化學發光成像分析儀中顯色,觀察到存在CD3(106 kDa)、CD19(53 kDa)條帶，同時由于分子間的相互作用力，有部分產物的存在形式是四聚體。

1.3 Tandab(CD3/CD19)與)與CD19+、CD3+血液病細胞的結合力觀察

1.3.1 Tandab(CD3/CD19)與CD19+、CD3+血液病細胞的直接結合力 采用FACS法。將終濃度為5 pmol/mL的純化Tandab(CD3/CD19)分別加入到1×106靶細胞(Raji、Daudi、BJAB、Jurkat和K562)中，孵育1 h，冷PBS洗滌3次。加入Alexa Fluor 488標記的抗His-tag抗體(終濃度為0.5 μg/mL)孵育30 min。冷PBS洗滌細胞2次。將細胞沉淀重懸于500 μL PBS。流式細胞分析儀(LSRII)中觀察Tandab(CD3/CD19)與相應靶細胞的直接結合力(出現與陰性對照不重合的曲線即視為具有結合力)。

1.3.2 Tandab(CD3/CD19)和HIT19a(或HIT3a)對CD19+、CD3+細胞的競爭結合力 采用FACS法。

將終濃度為5 pmol/mL的純化Tandab(CD3/CD19)加入到1×106細胞(Raji、Daudi、BJAB和Jurkat)中，共同孵育1 h，冷PBS洗滌3次。將細胞分為兩組，分別加入FITC標記的HIT19a或PE標記的HIT3a。4 ℃下共同孵育30 min，冷PBS洗滌細胞2次。將細胞沉淀重懸，流式細胞分析儀中測定Tandab(CD3/CD19)和HIT19a(或HIT3a)與靶細胞的競爭結合力(判定方法同上)。

1.4 Tandab(CD3/CD19)對PBMC的CD19+血液病細胞殺傷力影響檢測方法 采用乳酸脫氫酶釋放法。將Raji、Daudi、BJAB和K562細胞分為三組，96孔板中鋪入1×105個，按照效靶比E∶T=20∶1加入PBMC(IL-2刺激72 h)，分別加入終濃度為8、0.8、0.08 pmol/mL的Tandab(CD3/CD19)。采用CytoTox 96非放射性細胞毒性檢測試劑盒(Promega)，同時設置靶細胞自發釋放孔、效應細胞自發釋放孔、靶細胞最大釋放孔、體積校正對照孔及培養基背景對照孔，實驗孔和對照孔至少設置三個復孔。充分混勻后37 ℃ 繼續培養8 h。靶細胞最大釋放孔及體積校正對照孔在收集上清前45 min分別加入20 μL Lysis Solution。離心后從每孔吸50 μL上清至一個新的96孔平底板中。每孔加入配制好的底物液，室溫避光孵育。30 min后每孔中加入50 μL Stop Solution。1 h內于490 nm處測量各孔的光密度OD值，計算各濃度者PBMC的細胞毒性百分比。細胞毒性百分比=(OD值試驗孔-OD值效應細胞自發釋放孔-OD值靶細胞自發孔)/(OD值靶細胞最大孔-OD值靶細胞自發孔)×100%。

2 結果

Tandab(CD3/CD19)與Raji、Daudi、BJAB、Jurkat均出現與陰性對照不重合的曲線，即Tandab(CD3/CD19)可與Raji、Daudi、BJAB、Jurkat細胞結合，具有直接結合力。Tandab(CD3/CD19)可阻止單克隆抗體(HIT19a或HIT3a)與Raji、Daudi、BJAB、Jurkat細胞的結合，具有競爭結合力。

加入不同濃度Tandab(CD3/CD19)后PBMC細胞對Raji、Daudi、BJAB、K562細胞毒性百分比比較見表1。

表1 加入不同濃度Tandab(CD3/CD19)后PBMC細胞對四種細胞毒性百分比比較

注：與同種細胞前一濃度比較，*P<0.05。

3 討論

目前，各種惡性腫瘤的治療主要依靠化療藥物治療，放療減小病灶，手術切除等方式。靶向藥的應用就能很好的避免化療藥應用帶來的骨髓移植等不良反應，比如利妥昔單抗(美羅華)在國內的應用越來越普遍，而且沒有傳統化療藥的副作用，但價格較高。抗體治療同樣也具有靶向作用，在提高親和常數的同時，延長在體內的作用時間，降低副作用等方面，依然有很大的應用前景。相對于以二聚體形式存在的全抗，片段抗體如Fab、ScFv等通常會有結合活性弱以及半衰期短的問題[5，6]，影響了其實際應用。抗體二聚化具有能夠快速聚集到腫瘤處，有效清除腫瘤細胞等的優點[7]，促進了其發展。

在前期研究中，我們課題組曾試圖在片段抗體Fab重鏈的羧基端形成二硫鍵形成F(ab′)2，得到的抗體二聚化比率較低，抗體親和力也沒很大提高[8,9～13]。本研究通過引入二硫鍵，來形成同源二聚體，增加抗體二聚化程度以及提高了抗體親和力。眾所周知，能有效募集T細胞是殺傷腫瘤細胞非常重要的環節。至今，主要有兩種方法將其募集到腫瘤部位，第一種是通過嵌合抗原受體(CAR)修飾T細胞。為了進一步改良CAR的設計，甚至在CAR中不斷引入共刺激因子如CD28、4-1BB或OX40[14]。第二種是由雙特異性抗體(BsAbs)[15]介導來募集T細胞到腫瘤部位。這種抗體一端可以和T細胞結合，另一端可以和與腫瘤有關的抗原表位結合，進而介導T細胞殺傷腫瘤細胞。在這一點，本實驗室曾構建并表達過這種雙特異性抗體(antiCD19/antiCD3 diabody)，能有效募集T細胞而有效殺傷CD19陽性的B細胞淋巴瘤細胞和病人來源的B-ALL細胞[5,16]。

本研究中，我們根據antiCD19/antiCD3 diabody的序列成功構建了一種串聯四價雙特異性抗體Tandab(CD3/CD19)。這種抗體與CD3抗原和CD19抗原分別具有兩個結合位點。其形成的相對量由多肽鏈中間Linker的長度決定。有研究[8]表明，過短或過長的Linker都對TandAb 的形成不利。所以我們選擇了長度為15個氨基酸殘基的序列(3個重復的G4S序列)作為中間連接。本實驗室之前的一些研究表明在VH3和VL3適當位置引入半胱氨酸來形成二硫鍵可以提高融合蛋白的穩定性[5,10]在本課題中也有所應用。

綜上所述，Tandab(CD3/CD19)與CD19+、CD3+血液病細胞具有直接結合力和競爭結合力，并可促進PBMC對CD19+血液病細胞的殺傷力。這為后期在體內進一步驗證該四價抗體對CD19+腫瘤細胞的抑制作用，為抗體靶向治療的研究提供了理論依據。

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