薯蕷皂苷元對人多發性骨髓瘤RPMI8226細胞株增殖、侵襲、遷移影響及機制

尹靜,邵雪齋,李淑靜,于春燕,郭亞春,邢恩鴻,趙鑫

(1承德醫學院，河北承德 067000；2承德醫學院附屬醫院；3承德護理職業學院4石家莊第六醫院)

多發性骨髓瘤(MM)是漿細胞來源惡性增生血液性疾病，主要臨床表現為骨痛、免疫力下降、貧血、腎功能不全等[1]，MM多見中老年男性,發病率占血液系統惡性腫瘤10%～15%，占惡性腫瘤1%～2%[2]。目前發病率已超過急性白血病，僅次于非霍奇淋巴瘤，位于血液系統腫瘤第二位[3]。MM臨床發病率增加與MM的遷移、侵襲有關。MM基質細胞能分泌促進血管內皮生長因子如血管內皮生長因子(VEGF)、白細胞介素6(IL-6)、IL-8、IL-12等，促進MM遷移、侵襲。硼替佐米(BTZ)[4]是常用臨床治療MM藥物，初發患者治療效果較佳，復發、轉移患者出現耐藥、復發、轉移較多，效果不佳。薯蕷皂苷元(Dio)是薯蕷皂苷水解產物，屬于甾體皂苷元，廣泛存在薯蕷、百合、石竹等植物中[5]。具有抗炎[6～8]、抗腫瘤[9～10]、調節免疫[11～13]等功效。研究[14]發現，Dio對白血病、肝癌、宮頸癌、胃癌、小細胞肺癌等腫瘤的增殖、血管新生、凋亡均有一定作用，但Dio對MM患者治療作用目前尚未報道。2016年4月～2017年4月，我們通過實驗觀察薯蕷皂苷元(Dio)對人MMRPMI8226細胞增殖、遷移及侵襲影響，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器 MM細胞株(RPMI8226)為承德附屬醫院血液科饋贈；含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素培養RPMI8226細胞，放入37 ℃、5%CO2培養箱于2～3天換液，以900 r/min5 min后收取沉淀細胞，重懸后分2皿繼續培養。按7：2∶1的RPMI1640:胎牛血清:二甲基亞砜按配制凍存液，每管凍存1×106細胞，放入1.5 mL凍存液凍存備用。薯蕷皂苷元(Diosgenin，Dio)美國Sigma公司；噻唑藍(MP Biomedical)；RPMI1640(美國Gibco公司)；胎牛血清(天津康源)；青霉素-鏈霉素(美國Hyclone公司);Tranwell小室(BD公司)；Matrigel Basement Membrane Matrix);ECMgel 基質(BD公司)；二甲基亞砜(thermo公司)；IL-8humanELISA(thermo公司)；VEGF、IL-6humanELISA(武漢華美有限公司)。 高速低溫離心機(丹麥Labogene公司)、酶標儀(加拿大Biotek公司)；CSR-1-30型純水機(中國北京愛斯泰克公司)；倒置顯微鏡(中國Motic公司)。

1.2 Dio對RPMI8226細胞增殖影響 采用MTT法。取對數生長期RPMI8226細胞分1、2、3、4、5組，900 r/min離心5 min，調整終濃度細胞數為2×105/L，種96孔板(100 μL/孔)，將細胞分實驗組(1、2、3、4、組)和5組，每組設6個復孔。1、2、3、4組分別加入終濃度為 10、20、30、40 μmol/L的Dio，5組置于單純完全培養基中培養，不做任何處理。分別于培養箱中培養24、48、72 h，終止培養，每孔加入10 μL MTT溶液，繼續培養4 h，以2 000 r/min離心5 min，留取底部細胞，加入100 μL/孔二甲基亞砜，在490 nm波長的酶標儀中，震蕩10 min，檢測各孔光密度值(OD值)。參考文獻[15]計算藥物的半數抑制濃度(IC50)，選取高、中、低Dio濃度為40、30、20 μmol/L及最佳作用時間為48 h。

1.3 Dio對RPMI8226細胞遷移、侵襲能力影響 取對數生長期RPMI8226細胞，900 r/min離心5min，收集細胞，調整細胞終濃度2×105/L，將細胞分高、中、低Dio組、BTZ組、對照組，每組設8 mL。高、中、低濃度分別加入16、12、8 μL Dio原液，BTZ組BTZ濃度參考文獻[16],最終設定濃度為10 nmol/L。對照組不做任何處理，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h。1 500 g/min離心15 min，收集上清。放入-80 ℃保存備用。

1.3.1 各組細胞遷移力的觀察，采用細胞遷移實驗。收集各組細胞,Transwell 上室中加入 200 μL 細胞懸液。充分混勻。將高、中、低濃度組、對照組、BTZ組，分別放入下室。在37 ℃、5%CO2培養箱中培養48 h，終止后收集下室溶液，1 500 r/min、5 min離心，收集細胞沉淀，用20 μL完全培養基重懸后計數細胞遷移數。每組2個復孔，重復3次，取平均值。

1.3.2 各組細胞侵襲能力觀察 采用細胞侵襲實驗。收集各組細胞，ECMgel 基質膠置于4 ℃過夜，EP管、 Tip 頭、24孔培養板、Tranwell小室等均置于-20 ℃冰箱預冷30 min。將融化后 ECMgel 基質膠按1∶3比例與RPMI1640混勻后，Transwell 上室加入稀釋后ECMgel 基質膠，每孔50 μL，置培養箱中培養2 h，調整RPMI8226細胞終濃度2×105/mL置于上室。加入600 μL于下室，置37 ℃、5%CO2培養箱培養48 h，終止后收集下室溶液，1 500 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，用20 μL完全培養基重懸計數各組細胞侵襲數量。每組2個復孔，重復3次，取平均值。

1.3.3 各組細胞上清IL-6、VEGF、IL-8蛋白檢測 采用ELISA法。VEGF、IL-6、IL-8檢測參照試劑盒說明，配不同濃度標準品，標準品濃度設2 000、1 000、500,250、125、62.5、31.25、0 pg/mL，取各組樣本上清置于室溫10 min，1 000 g/min離心5min，將樣本、標準品100 μL置于小室中。覆蓋酶標板貼，常溫孵育2 h。加入生物素標記抗體100 μL，敷板貼，37 ℃孵育1 h。洗3次，甩干。再加入100 μL辣根過氧化物酶標記抗體，敷板貼，37 ℃孵育1 h，洗5次甩干，每孔加入90 μL底物溶液，4 min室溫，加入50 μL終止液，立即在450 nm波長酶標儀震板30 s后檢測各孔光密度值(OD值)。根據樣品吸光值在坐標上找出樣本濃度，每組設2個復孔，各組重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組細胞OD值比較 不同培養時間各組細胞OD值比較見表1。隨培養時間增加，1、2、3、4組細胞OD值增加(P均<0.05)；隨作用濃度增加，細胞OD值增加(P均<0.05)。

表1 不同培養時間各組細胞OD值

2.2 各組細胞遷移、侵襲細胞數比較培養48 h各組細胞遷移、侵襲細胞數比較見表2。

表2 培養48 h各組細胞遷移、侵襲細胞數比較

注：對照組比較，*P<0.05 ;與 BTZ組比較，ΔP<0.05。

2.3 各組上清液IL-6、VEGF、IL-8相對表達量比較 培養48 h各組上清液IL-6、VEGF、IL-8相對表達量比較見表3。

表3 培養48 h各組上清液IL-6、VEGF、IL-8相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與BTZ組比較，ΔP<0.05 。

3 討論

MM是漿細胞來源的B細胞惡性增殖性腫瘤，發病率位居惡性血液系統腫瘤第二位[17]。MM細胞和骨髓瘤基質細胞都分泌IL-6,IL-6與MM細胞增生、凋亡密切相關，MM微環境中IL-6可以刺激MM細胞增殖，同時，MM可以通過自分泌和旁分泌IL-6。VEGF可以刺激MM旁分泌IL-6,IL-6又可以促進VEGF的產生，二者存在一定相關性。研究[18]表明，IL-8為炎性趨化因子，中心粒細胞、巨噬細胞、內皮細胞、多種腫瘤細胞都可以分泌IL-8，MM患者的骨髓基質細胞、內皮細胞可產生IL-8。MM復發、轉移與MM侵襲力、血管新生、黏附能力強有關。其因子有腫瘤壞死因子(TNF)、IL-10[19]、IL-17、IL-4、IL-2、VEGF、IL-6、IL-8、血漿單核細胞趨化因子-1(MCF-1)因子有關。VEGF是促進血管新生的主要因子，在惡性血液系統疾病中起著重要的作用，VEGF增加血管通透性，促進血液中蛋白滲出，是腫瘤基質中新生毛細血管形成的基礎；VEGF可激活蛋白酶，降解基底膜，有利于內皮細胞的遷移。VEGF還為腫瘤的生長提供營養并帶走代謝過程中廢物。IL-8可增加破骨及溶骨性，刺激外周血細胞直接轉化為破骨細胞，進一步造成骨損傷，惡性期MM比穩定期MM骨髓中IL-8的表達量高，IL-8和IL-6的分泌量存在相關性，IL-8可誘導MM細胞增殖及趨化，促進血管新生，故MM侵襲、遷移和IL-8有相關性。目前，MM臨床用藥主要為BTZ[20,21]，BTZ可促進MM的凋亡、抑制其增殖，通過抑制MM骨髓基質、MM分泌IL-6，抑制其增殖，減弱侵襲、遷移能力。

MM患者復發率高，這與血管新生有著密切關系。MM目前尚無有效治療方法，如何提高復發MM患者的生存期，是目前學術界需要解決的問題。研究表明，Dio能夠能抑制實體腫瘤血管新生[22,23]，增強機體免疫系統活性，減少腫瘤細胞的黏附作用，對于抑制實體腫瘤血管新生有一定效果。同時，Dio還具有較小毒副作用。

本研究用不同濃度Dio作用于RPMI8226細胞不同時間，觀察到Dio可以抑制RPMI8226細胞增殖，增殖抑制能力與藥物濃度、作用時間成正比。與對照組比較，BTZ組、高、中、低Dio濃度遷移、侵襲細胞數減少;與BTZ組比較，高、中、低組Dio濃度遷移、侵襲細胞數減少。與對照組比較，其余各組IL-6、VEGF、IL-8上清中蛋白相對表達量減少;與BTZ 組比較，高、中、低Dio濃度IL-6、VEGF、IL-8的表達量減少。Dio可以明顯降低上清中VEGF、IL-6、IL-8 表達量，同時，通過減少VEGF、IL-6、IL-8的分泌，減少血管新生。

綜上所述，Dio能夠抑制RPMI8226細胞的增殖、遷移、侵襲。其機制可能與其下調細胞IL-6、VEGF、IL-8的表達有關。

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