扭轉原腸胚形成同系物1基因過表達對人胃腺癌細胞株BGC-823增殖的影響

袁靜怡，曾嘉麗，帥春，劉玥，3

(1南方醫科大學基礎醫學院，廣州 510515；2 廣東省婦幼保健院；3廣東省生物芯片重點實驗室)

胃癌是來源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，發病率居于惡性腫瘤第五位[1]，病死率居于癌癥病死率第二位[2,3]。我國胃癌發病率居高不下[4]。目前臨床尚無有效的胃癌治療方法。扭轉原腸胚形成同系物1(TWSG1,在非哺乳類脊椎動物中稱為Tsg)是一種高度保守的分泌蛋白，最早發現于果蠅屬中[5],其表達產物是分泌型的BMP綁定糖蛋白，參與多種疾病的調控[6]。研究[7]發現，TWSG1基因在膽管癌和肝癌組織細胞中的表達量比正常細胞明顯升高。在人惡性間皮瘤中，TWSG1基因啟動子區域CpG島的異常甲基化可能促進腫瘤細胞生存能力，或當暴露于分化不利的條件時，將會導致腫瘤異質性[8]。Alexandra 等[9]研究發現，在結直腸癌中TWSG1可能是一個典型的癌癥抑制基因。因此，可推測TWSG1在不同腫瘤的發生、發育、轉移過程中的作用機制存在差異。而有關于TWSG1基因在胃腺癌發生、發展中的作用機制相關報道較少。2016年1月～2017年6月，我們構建TWSG1基因真核表達質粒，并用其轉染人胃腺癌細胞株BGC-823，觀察其對BGC-823細胞增殖的影響。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 感受態大腸桿菌DH5α為本實驗室制備，人胃腺癌BGC-823細胞和pTSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-EGFP-F2A-PuroR質粒為南方醫院中心實驗室保存。BGC-823于RPMI-1640完全培養基中培養(內含10%滅活小牛血清+1%雙抗(100 units/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素)。細胞置于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養，并進行常規更換培養液與傳代操作。質粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司)、限制性內切酶、DNA Ladder、核酸膠回收試劑盒，以及T4DNA連接酶和Taq聚合酶(Takara公司)，轉染試劑脂質體LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)，Trizol(Invitrogen公司)、逆轉錄試劑盒(Invitrogen公司)，SYBR Premix Ex Taq TMⅡKit(Takara公司),RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)，PVDF膜(millipore公司)，TWSG1兔抗人多克隆抗體(Abcam公司)，HRP標記的羊抗兔IgG(北京天德悅公司)，ECL發光液(美國Thermo Scientific Pierce公司)，CCK8(日本DOJINDO)。細胞培養皿(Corning公司)、六孔板(Corning公司)、EP管(Corning公司)和八聯管(Corning公司)。測序由上海生工公司完成，克隆引物和RT-qPCR引物由上海生工公司合成。離心機(Beckman公司)； Infinite M200酶標儀(Tecan公司)；NanoDrop2000超微量分光光度計(Thermo公司)；小型水平電泳儀(Bio-Rad公司)；EclipseTi-s熒光倒置顯微鏡(Nikon公司)；7500Real-TimePCR儀(AppliedBiosystems公司)。

1.2 TWSG1基因真核表達質粒的構建 擴增TWSG1基因，上下游引物分別為5′- GAATTCATGAAGTTACACTATGTTGCTGTG-3′；5′- GGATCCTTAAAACATGCAGTTCATACATTTG-3′，反應條件為95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s，共40個循環。擴增產物和pTSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-EGFP-F2A-PuroR質粒同時采用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切后進行連接，轉化感受態大腸桿菌DH5a，挑取陽性菌落。菌落擴大培養后按照天根質粒小提試劑盒步驟進行質粒的抽提，用NanoDrop2000超微量分光光度計測定質粒DNA濃度及純度，用EcoR Ⅰ和BamH I進行雙酶切鑒定，根據DNA Ladder鑒定目的基因克隆的正確性，并將酶切鑒定為陽性克隆質粒進行測序鑒定。

1.3 BGC-823細胞分組及TWSG1真核表達質粒轉染 取對數生長期細胞接種于6孔板中，將細胞分為觀察組和對照組，待細胞匯合率達70%～80%時觀察組和對照組分別轉染TWSG1真核表達質粒、空白質粒載體，所有操作均按照LipofectamineTM2000脂質體說明書進行。然后加入1 μg/mL嘌呤霉素篩選至出現單克隆，取多個單克隆分別加入0.5 μg/mL嘌呤霉素繼續培養，篩選穩定表達TWSG1的細胞株。經鑒定后觀察組重組表達質粒測序鑒定結果測序結果與NCBI收錄的人TWSG1基因序列完全相同。

采用Real-Time PCR法檢測兩組細胞TWSG1基因。采用TRIzol提取總RNA，擴增TWSG1基因，上下游引物分別為5′-GGTCATATGAGAAGCAGGTG-3′；5′-GTGTGCTAACAGTAGCACATG-3′，以GAPDH為內參，上下游引物分別為5′-CAAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′；5′-CATACCAGGAAATGAGCTTGAC-3′，反應條件為95 ℃預變性30 s；95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40個循環。TWSG1相對表達量以2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=[(樣本Ct目的基因-樣本Ct內參基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct內參基因)]。 采用Western blotting法檢測TWSG1蛋白。收集各組細胞，加入RIPA細胞裂解液提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳，轉PVDF膜，封閉后加入一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶6 000稀釋)室溫孵育1 h，ECL化學發光。用圖像分析系統分析,以相應目的蛋白條帶的積分光密度值表示TWSG1蛋白的表達情況。實驗重復3次，取平均值。

1.4 兩組細胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。取轉染48 h各組細胞，接種于96孔板內，每組設9孔，每孔約1×103個細胞，連續培養3天。分別于24、48、72 h取出3孔細胞，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃、5% CO2的培養箱孵育4 h后，酶標儀在450 nm波長處測定并記錄各組光密度值(OD值)。

2 結果

兩組細胞TWSG1基因及蛋白相對表達量比較見表1。

表1 兩組細胞TWSG1基因及蛋白相對表達量比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

培養24、48、72 h時兩組細胞OD值比較見表2，兩組細胞生長曲線見圖2。與對照組比較，培養24、48、72 h時觀察組細胞OD值均降低(P均<0.05)。

表2 培養24、48、72 h時兩組細胞OD值比較

注：與空白組、對照組比較，*P<0.05；與本組前一培養時間比較，#P<0.05。

圖2 兩組細胞生長曲線

3 討論

TWSG1基因編碼保守性的疏水蛋白，在非洲爪蟾蜍中，Tsg通過其與腱蛋白相似的富含半胱氨酸殘基的結構域直接與BMPs結合[10]。目前關于TWSG1的大部分研究是探討其通過BMP信號調節鐵調素的表達，有研究認為TWSG1能下調鐵調素的表達[11,12],其機制可能與BMP信號轉導有關。Forsman 等[13]發現TWSG1可通過激活BMP信號通路，促進乳腺導管分支、簇狀結構形成等發育過程，而Yamada 等[14]發現在腎小球硬化癥中 TWSG1是BMP主要的負調節因子。目前關于TWSG1的大部分研究是探討其通過BMP信號調節鐵調素的表達，TWSG1能下調鐵調素的表達[15,16],其機制可能與BMP信號轉導有關[17]，Tanno 等[18]發現TWSG1在β-球蛋白生成障礙性貧血老鼠中表達顯著上調。同時，國內有研究[19]發現TWSG1在慢性高原病大鼠的肝組織中表達上調。此外，TWSG1參與許多生長發育進程，Tanno 等[20]發現其可調控早期胚胎發育， Heinke 等[21]認為其參與血管細胞的動態平衡調節。

從目前的研究狀況來看，TWSG1對不同的腫瘤細胞的調控具有雙向性，有研究發現在結直腸癌中TWSG1可能是一個典型的癌癥抑制基因[9],其在許多結直腸癌組織中檢測到存在缺失。此外，Forsman 等[22]發現在小鼠乳腺發育的重要時間點均有TWSG1的表達，其對乳腺癌的發生起到重要作用。而Xia 等[23]發現TWSG1在轉移型乳頭狀甲狀腺癌中的表達高于非轉移型乳頭狀甲狀腺癌，敲低TWSG1的表達能夠抑制轉移型乳頭狀甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，由此推斷其可能是乳頭狀甲狀腺癌的新型診斷以及治療靶點。他們還發現當TWSG1在K1細胞表達下調時，Id1和p-Smad1/5的mRNA和蛋白表達水平顯著下降。而當TWSG1在TPC1細胞中過表達時Id1和p-Smad1/5的表達也增強。他們推論TWSG1可以激活乳頭狀甲狀腺瘤細胞中的BMP信號通路。Johnston 等[7]通過對含有肝癌和膽管細胞癌的組織芯片進行免疫組化分析，發現免疫組化和WB的結果均顯示膽管細胞癌的TWSG1表達量高于肝癌，且高表達于上皮細胞區域，而通過免疫組化技術發現BMP4也高表達于膽管細胞癌，此差異有統計學意義。于此同時，他們檢測到TWSG1高表達于人膽管細胞癌細胞系(OZ;Huh-28;HuCCT-1)和人肝癌細胞系HepG2,但是在人肝正常上皮細胞THLE-3內不表達。而通過WB技術發現BMP4也高表達于人膽管細胞癌細胞系(OZ;Huh-28;HuCCT-1)，在HepG2和THLE-3細胞中均有一定表達。因此他們推斷肝癌和膽管細胞癌組織中TWSG1的高表達能夠激活BMP4分子，進而激活BMP信號通路。

然而，關于TWSG1對胃癌的作用的研究報道就十分有限，有研究[24]發現NKX6.3是小鼠胃部幽門中G/D細胞系的一種選擇性調控因子，其可直接結合TWSG1基因轉錄起始位點的啟動子上游序列，從而提高TWSG1的mRNA和蛋白表達量。與此同時，NKX6.3并不會影響BMPR-II蛋白表達量。接著通過免疫共沉淀技術發現在AGS細胞和MKN1細胞中NKX6.3誘導TWSG1與BMP4分子結合，并抑制BMP4分子與BMPR-II分子的結合，而沉默NKX6.3或TWSG1基因能使BMP4分子重新與BMPR-II分子結合。當BMP4分子與BMPR-II分子的結合受到抑制時，能導致BMP-SMAD信號通路失活，最終抑制胃黏膜的腸化生，減少胃癌的發生率。

綜上所述，TWSG1基因過表達可抑制BGC-823細胞的增殖。

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