高活性云芝α－半乳糖苷酶發酵培養基的優化*

雷 萍，吳亞召，張文雋，杜 芳,**，王賀祥

（1.陜西省微生物研究所，陜西 西安710043；2.農業生物技術國家重點實驗室，中國農業大學生物學院，北京 100193）

α－半乳糖苷酶（α－Galactosidase，α－Gal）又稱蜜二糖酶、α－半乳糖苷鍵水解酶，可水解非還原性末端以α－1，6鍵結合的半乳糖苷健，因此可水解含有α－半乳糖苷鍵的雜多糖和棉籽糖、水蘇糖、蜜二糖等低聚糖[1]。α－半乳糖苷酶可以降解不溶性低聚糖，提高豆類制品的代謝能力，消除脹氣，還可改造并改變藥物理化性質，增加藥物穩定性等，因此被廣泛應用于飼料業、食品業、制藥業和科學研究等領域[2]。

α－半乳糖苷酶普遍存在于人、動物、植物和微生物中，其中由于微生物具有分布廣、種類多、生長快等優點成為生產α－半乳糖苷酶的主要目標[3]。上世紀70年代末期我國學者對微生物產α－半乳糖苷酶及其酶學特性開始進行研究，目前已篩選出多株產α－半乳糖苷酶活性的微生物菌種，并制備分離出越來越多的純化酶，取得了較大進展。有研究學者從多種大型真菌子實體和發酵液中檢測并分離到高活性的α－半乳糖苷酶[4]。云芝（Coriolus versicol－or）是珍貴的藥用真菌，具有提高免疫、抗腫瘤、降血糖等藥用價值。我們在云芝子實體中檢測到高活性α-半乳糖苷酶的存在，但是子實體生成周期較長，提取成本增加，因此利用發酵法生產云芝α-半乳糖苷酶成為1種有效途徑。本研究擬對云芝發酵生產高活性α-半乳糖苷酶的誘導劑和發酵培養基進行研究，為更進一步開發應用α-半乳糖苷酶提供試驗理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

云芝菌種由陜西省微生物研究所微生物資源中心第三研究室提供。

1.2 培養基

1.2.1 母種培養基

綜合PDA培養基。

1.2.2 液體種子培養基

豆粕粉2%、磷酸二氫鉀0.1%。

1.2.3 誘導物篩選基礎培養基

蛋白胨2%、磷酸二氫鉀0.5%，去離子水100mL。

1.2.4 液體發酵基礎培養基

豆粕粉6%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.1%。

1.2.5 液體發酵培養基

豆粕粉2%、半乳糖1%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.1%。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

按1.2.2配方配制種子液培養基，采用250 mL三角瓶裝入50 mL種子液，加入10粒～15粒玻璃珠，高壓滅菌后接入云芝試管菌種，于搖床培養6d，培養條件為振蕩頻率180 r·min-1，溫度26℃。

1.3.2 誘導物篩選試驗

在誘導物篩選基礎培養基中分別添加葡萄糖2%、蔗糖2%、半乳糖2%、棉籽糖2%、豆粕粉6%、玉米粉6%，高壓滅菌后接入云芝試管菌種，于搖床培養，振蕩頻率180 r·min-1，溫度26℃。每天取樣進行發酵液中α-半乳糖苷酶活性的測定。

1.3.3 碳源篩選試驗

在液體基礎發酵培養基中分別加入0.5%、1%、2%三個含量的葡萄糖、蔗糖、半乳糖、玉米粉、棉籽糖，高壓滅菌后接入3%的種子培養液，于搖床培養，振蕩頻率180 r·min-1，溫度26℃。重復3次，以基礎培養基為對照。

1.3.4 氮源篩選試驗

在液體基礎發酵培養基中分別加入4%、6%、8%三個含量的蛋白胨、酵母粉，0.4%、0.8%、1.2%三個含量的硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨，高壓滅菌后接入3%的種子培養液，于搖床培養，振蕩頻率180r·min-1，溫度26℃。重復3次，以基礎培養基為對照。

1.3.5 無機鹽篩選試驗

在只含有6%豆粕粉的液體基礎發酵培養基中分別加入0.05%、0.1%和0.2%三個含量的硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鐵，高壓滅菌后接入3%的種子培養液，于搖床培養，振蕩頻率180 r·min-1，溫度26℃。重復3次，以基礎培養基為對照。

1.3.6 正交優化試驗

根據單因素篩選試驗結果，對篩選出的豆粕粉（A）、半乳糖（B）、硫酸鎂（C）和磷酸二氫鉀（D）進行四因素三水平正交優化試驗，見表1。

表1 L9(34)正交試驗的因素及水平Tab.1 Factors and their levels in L9(34)orthogonal test

1.3.7 α-半乳糖苷酶活性的測定

吸取0.1 mL適當稀釋后的粗酶液，再加入同體積的10 mmol·L-1對硝基苯基α-D-吡喃半乳糖苷作為底物，在40℃恒溫條件下振蕩反應10 min，再加入0.5 mol·L-1Na2CO3溶液0.8 mL振蕩混勻，在405nm波長處測定吸光值。

酶活力單位定義：在一定條件下，每分鐘生成1 μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活力單位[5]。

2 結果與分析

2.1 不同誘導物對云芝發酵液產酶的影響

不同誘導物對云芝發酵產α-半乳糖苷酶的影響情況見圖1。

由圖1可以看出，以豆粕粉為誘導物時，培養至第7天在發酵液中檢測到α-半乳糖苷酶，酶活性為38.78 U·mL-1，第13天時酶活性迅速增至180.71 U·mL-1，培養至第14天酶活性達到最大值213.73 U·mL-1；以玉米粉為誘導物時，發酵初期檢測不到α-半乳糖苷酶的活性，培養至第11天時檢測到酶活性僅為28.17 U·mL-1，繼續發酵到第15天時酶活性達到最大值73.98 U·mL-1；以棉籽糖為誘導物時，培養至第14天時才檢測到α-半乳糖苷酶的活性，為32.82 U·mL-1，第 16 天時酶活性為 83.94 U·mL-1；以葡萄糖、半乳糖和蔗糖為誘導物時，直至發酵至第16天時才檢測到α-半乳糖苷酶，但活性均較低，分別為 9.21 U·mL-1、13.38 U·mL-1和 8.24 U·mL-1。因此，云芝發酵生產α-半乳糖苷酶的最佳誘導物為豆粕粉。

圖1 誘導物對α-半乳糖苷酶發酵的影響Fig.1 Effect of different inducer sources on the α-galactosidase fermentation

2.2 不同碳源對云芝發酵液產酶的影響

不同碳源對云芝發酵產α-半乳糖苷酶的影響情況見圖2。

圖2 碳源對α-半乳糖苷酶發酵的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on the α-galactosidase fermentation

從圖2可以看出，添加0.5%半乳糖對發酵液中α-半乳糖苷酶活性的影響最大，酶活性達到259.40 U·mL-1，高于對照培養基（222.50 U·mL-1），添加0.5%蔗糖時發酵液中酶活性為212.00 U·mL-1，低于對照培養基；隨著半乳糖和蔗糖濃度的增加，酶活均隨之降低；添加葡萄糖、棉籽糖和玉米粉對發酵產α-半乳糖苷酶沒有促進作用。因此，云芝發酵生產α-半乳糖苷酶的最佳碳源為半乳糖。

2.3 不同氮源對云芝發酵液產酶的影響

不同氮源對云芝發酵產α-半乳糖苷酶的影響情況見圖3。

圖3 氮源對α-半乳糖苷酶發酵的影響Fig.3 Efect of different nitrogen sources on the α-galactosidase fermentation

從圖3可以看出，添加的幾種氮源均使發酵液中α-半乳糖苷酶酶活性低于對照培養基（185.9 U·mL-1），尤其是添加8%酵母粉時酶活性降至38.67 U·mL-1，而且同一種氮源隨著濃度的升高，產α-半乳糖苷酶的能力也隨之降低。因此，云芝發酵生產α-半乳糖苷酶的培養基中不需要額外添加氮源，誘導物豆粕粉在誘導α-半乳糖苷酶產生的同時，也作為有機氮源為其生長提供營養。

2.4 不同無機鹽離子對云芝發酵液產酶的影響

不同無機鹽離子對云芝發酵產α-半乳糖苷酶的影響情況見圖4。

圖4 無機鹽離子對α-半乳糖苷酶發酵的影響Fig.4 Effect of different ions on the α-galactosidase fermentation

從圖4可以看出，添加0.05%MgSO4和0.1%KH2PO4對發酵液中α-半乳糖苷酶的產生有促進作用，酶活均高于對照培養基（187.96 U·mL-1），分別為197.26 U·mL-1和196.93 U·mL-1，且差異不明顯；添加任何濃度的CaCl和FeSO4均不利于α-半乳糖苷酶的產生，酶活性均低于對照培養基。因此，云芝發酵生產α-半乳糖苷酶的無機鹽應選取硫酸鎂和磷酸二氫鉀。

2.5 正交試驗優化培養基的結果與直觀分析

L9(34)正交試驗優化培養基的結果分析見表2。

表2 L9(34)正交試驗結果直觀分析表Tab.2 Intuitive analysis table for the result of L9(34)orthogonal test

從極差分析結果可以看出，各因素影響云芝發酵產α-半乳糖苷酶能力的順序依次為：D＞A＞B＞C，其中影響最為顯著的是MgSO4，其次是豆粕粉和半乳糖，KH2PO4影響不顯著。從表中還可以看出，正交試驗優水平組合A1B1C2D2為最優組合，即優化后的云芝發酵培養基為：豆粕粉2%、半乳糖0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%。以優化獲得的培養基進行發酵培養8 d，重復3次，發酵液中α-半乳糖苷酶的酶活性平均值為301.6 U·mL-1，表明此配方合理，達到了優化培養基的目的。

3 結論

通過單因素篩選試驗確定了云芝發酵產α-半乳糖苷酶的最佳誘導物為豆粕粉，以其作為發酵培養基固定組成，進一步試驗發現發酵產酶的最佳碳源為半乳糖，誘導物豆粕粉起到氮源的作用為其生長提供營養，不需要額外添加氮源物質，無機鹽宜選取 MgSO4和 KH2PO4。

通過L9(34)正交試驗優化云芝發酵產α-半乳糖苷酶的培養基，確定最優培養和組合為：豆粕粉2%、半乳糖0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%，發酵培養8 d，酶活性可達301.6 U·mL-1。

參考文獻：

[1]杜芳.雞樅菌和云芝中α-半乳糖苷酶的研究[D].北京：中國農業大學，2014.

[2]楊冠東，劉芳，李荷.飼用α-半乳糖苷酶的研究進展概況[J].現代食品科技，2006，22（3）：275-179.

[3]郝桂娟，張凱，王學智，等.α-半乳糖苷酶的研究進展[J].中國畜牧獸醫，2013，40（3）：149-154.

[4]Ramalingam,Saraswathy N,Sadasivam S,et al.Purification and properties of alpha-galactosidase from white-rot fungus Pleurotus florida [J].Indian Journal of Biochemistry&Biophysics,2007,44(2):76-81.

[5]Rezessy-Szabó JM,Nguyen QD,Hoschke á,et al.A novel thermostable α-galactosidase from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus CBS 395.62/b:Purification and characterization[J].Biochimica Et Biophysica Acta General Subjects,2007,1770(1):55-62.