中空纖維離心超濾法測定乳制品中5種添加劑

劉彥，張巖，付海麗，劉睿思，蔣曄

（河北醫科大學藥學院，河北石家莊050017）

山梨酸、苯甲酸和脫氫乙酸均具有抑菌或抗菌作用，常作為防腐劑用于食品工業生產中；安賽蜜和糖精鈉為常用的食品矯味劑，一般在食品加工中用來改善口味。上述5種食品添加劑均廣泛應用于各類食品中，但過量攝入會對人體造成危害，特別是肝、腎器官，甚至引發癌癥[1]。因此，在國家頒布的GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[2]中對乳制品中食品添加的類別和限量做了明確規定，安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的限用量分別為0.3、1.0、0.5、0.3 g/kg，含乳飲料中糖精鈉的限用量為0.15 g/kg。

目前，已有文獻報道食品中防腐劑和矯味劑的含量測定方法，常見的有高效液相法（chromatography high performance liquid，HPLC）[3-7]、毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）[8]、氣相色譜法 （gas chromatography，GC）[9]、離子色譜法[10]、高效液相質譜聯用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[11]等。由于乳制品基質較為復雜，含有大量蛋白質、脂肪等可影響色譜分析準確度的大分子物質，因此，該類樣品分析檢測前需進行樣品前處理。文獻中去除蛋白質等大分子物質常采用沉淀蛋白法[12-15]，或聯合液液萃取[16]、固相萃取[17]等方法對樣品進一步純化，操作過程繁瑣、耗時，且易造成偶然誤差降低結果準確度。因此，本文采用新型的中空纖維離心超濾裝置，無需沉淀蛋白，一步即可完成分離、純化過程，且首次用于同時測定乳制品中的安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉和脫氫乙酸的含量，其結果準確、可靠。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與樣品

U3000高效液相色譜儀：戴安（美國）；聚砜中空纖維、聚丙烯中空纖維（膜厚 200 μm，內徑 1 mm）：杭州凱潔膜分離技術有限公司；苯甲酸對照品（批號：100419-201302）：中國藥品生物制品檢定所；山梨酸對照品（批號：40124）：德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH；糖精鈉對照品（批號：40904）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；安賽蜜（批號：60263-06-1）：中檢所；脫氫乙酸（批號：YSJ-04260G）：上海遠慕；早餐奶（批號：2P20170616 BU03）：內蒙古蒙牛乳業股份有限公司；酸奶（批號：20170712.05）：北京三元食品股份有限公司；養樂多（批號：20170708）：養樂多（中國）投資有限公司；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

采用DiamonsilC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-0.02mol/mL乙酸銨溶液（4∶96，體積比），流速為1.0mL/min，檢測波長分別為230 nm（安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸）、254nm（糖精鈉），進樣量5μL。

1.3 溶液配制

對照品溶液：精密稱取安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸對照品分別為 10.00、10.02、10.01、10.00、9.98 mg，置10 mL量瓶中，加少量甲醇溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，分別得對照品貯備液濃度為1.000、1.002、1.001、1.000、0.998 mg/mL。

供試品溶液：精密稱取待測樣品溶液1.0 mL，置5 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即得樣品溶液。

1.4 中空纖維離心超濾法

將中空纖維切成15 cm的小段，放入甲醇-水（50∶50，體積比）混合溶液中超聲清洗30 min，晾干備用。吸取0.5 mL樣品溶液注入自制玻璃管（長度：7.5 cm，內徑：3 mm），將洗好備用的中空纖維置于玻璃管中（裝置圖見圖1），以4 000 r/min離心15 min，然后取出中空纖維，收集中空纖維內的液體，即得供試品溶液。

圖1 離心超濾裝置圖Fig.1 Diagram of hollow fiber ultrafiltration

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的優化

2.1.1 樣品前處理方法的選擇

乳制品基質復雜，含有大量蛋白質、脂肪等大分子物質，可影響色譜分析，因此，檢測前均需進行樣品前處理。傳統的乳制品樣品前處理方法均為沉淀蛋白法，或聯合液相萃取、固相萃取等方法，操作繁瑣、費時，且易造成損失導致結果誤差較大。而中空纖維離心超濾技術主要應用于復雜基質中小分子物質的分離、純化，如成分復雜的制劑中小分子物質的檢測[18]、藥物小分子與高分子聚合物的分離[19-20]或游離藥物的測定[21]等。該方法僅通過離心操作即可去除蛋白質等大分子雜質，濾液可直接進樣，裝置簡單，操作快捷；且在該方法中離心力的方向與中空纖維的軸向方向始終處于平行的狀態，有利于克服濃差極化現象，使得結果更加準確、可靠。因此，本文采用中空纖維離心超濾法用于乳制品中防腐劑和矯味劑的分析測定。

2.1.2 非特異性吸附的考察

非特異性吸附是中空纖維膜分離過程中的常見現象，因此，本試驗分別考察了聚砜、聚丙烯兩種膜材對苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、脫氫乙酸和糖精鈉的吸附性。取濃度為10 μg/mL的混合對照溶液，按1.4項下進行離心超濾，進樣分析并計算回收率。結果表明：膜材為聚砜的中空纖維對脫氫乙酸和安賽蜜有明顯的吸附作用，回收率＜70.0%；而膜材為聚丙烯的中空纖維對5種待測物質幾乎不吸附，回收率＞93.5%，故選擇聚丙烯中空纖維作為膜材料。

2.1.3 離心轉速的優化

采用樣品前處理方法是離心超濾法，濾過速度和濾過液的量主要取決于離心力。文中考察了離心時間為 15 min 時，離心轉速分別為 2 000、4 000、6 000、8 000 r/min濾過液的量，結果表明，當離心轉速為4 000 r/min時濾過液體積基本趨于穩定，因此，選擇離心條件為 4 000 r/min，15 min。

2.2 系統適用性試驗

在1.2項色譜條件下，分別取5種混合對照品溶液（濃度約為20 μg/mL）及早餐奶加樣樣品溶液（5.05 μg/mL）進樣分析，記錄色譜圖（圖2），由圖可見，5種待測物質在上述色譜條件下完全分離，峰形良好，且供試品溶液未有干擾。

圖2 混合對照品溶液、早餐奶加樣樣品溶液色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of mixed reference substance solution and sample solution

2.3 線性、檢測限和定量限

分別精密量取安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉對照品貯備液各1.0 mL，置10 mL量瓶中，加流動相定容，得各組分濃度約為100 μg/mL混合對照溶液，依次稀釋得各組分濃度分別為0.50、1.00、5.00、10.0、20.0、50.0 μg/mL 的混合對照溶液，按 1.2 項下色譜條件測定，以各組分峰面積對其質量濃度進行線性回歸，結果見表1。

取對照品溶液，逐級稀釋各對照品進樣，當峰高為基線噪音的3倍和10倍量時，測得5種待測物質的檢測限及定量限，結果見表1。

表1 線性回歸方程及相關系數Table 1 The equations of linear regression and correlation coefficients

2.4 精密度、穩定性與重復性試驗

取濃度為10.0 μg/mL的混合對照品溶液，按1.2項下色譜條件，連續進樣6次，記錄各待測物質峰面積，計算得安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸和糖精鈉峰面積的RSD分別為0.8%、0.3%、0.2%、0.2%、0.2%，結果表明該方法精密度良好。

取早餐奶一份，5種待測物質加樣濃度為10.0 μg/mL，按1.4項下方法制備供試品溶液，分別放置0、2、4、6、8 h進樣，記錄峰面積，計算得5種待測物質峰面積的RSD均小于1.0%，結果表明供試品溶液在8 h內穩定。

取同一早餐奶樣品5份，5種待測物質加樣濃度為10.0 μg/mL，按1.4項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定，記錄峰面積，計算得5種待測物質峰面積的RSD均小于1.3%，結果表明該方法重現性良好。

2.5 回收率試驗

精密量取早餐奶、酸奶、養樂多各9份，每份1.0mL，置5 mL量瓶中，每種樣品3份為一組共3組，3組樣品分別加入各待測物質的對照品儲備液25、50、100 μL，加水定容，得加樣濃度分別為5.00、10.0、20.0 μg/mL的樣品溶液。按照1.4項下方法制備供試品溶液，記錄峰面積，得回收率結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n=3）Table 2 Results of the recovery tests（n=3）

2.6 樣品測定

取早餐奶、酸奶、養樂多3種樣品，按照1.4項下方法制備供試品溶液，分別對早餐奶、酸奶、養樂多中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸含量進行分析測定（色譜圖見圖3），每種樣品平行制備3份，取含量平均值，結果見表3。由結果可知，僅在養樂多樣品中檢測到苯甲酸，含量未超標，符合GB 2760-2014要求范圍。

圖3 早餐奶樣品、酸奶樣品、養樂多樣品色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of breakfast milk sample solution，youhurt sample solution and YangLeDuo sample solution

表3 樣品含量測定結果Table 3 The determination results of sample content

3 結論

建立中空纖維離心超濾法用于分析乳制品中5種食品添加劑的含量，該方法經一步樣品前處理方法即可除去乳制品中大分子物質，省時省力，且準確度高，回收率均大于93.5%，RSD<1.4%，為乳制品中食品添加劑的含量分析提供了簡便、快捷、可靠的檢測手段。

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