促進桉樹焦枯病菌大量產孢的方法

郭朦朦，丁 奕，楊澤慧，張清華，馮麗貞，宋 漳

（福建農林大學 林學院，福建 福州 350002）

麗赤殼屬（Calonectria）為廣譜寄生真菌，可致多種植物病害，引起木本植物根腐、莖腐、葉斑以及焦枯等癥狀[1-3]。桉樹焦枯病菌（Cylindrocladium leaf blight）是熱帶及亞熱帶桉樹種植區內危害最嚴重的病害之一，也是我國林業檢疫性病害[4-8]。其主要癥狀為受害葉片頂端開始呈現焦枯狀、在枯葉表面形成黑色小點，病健交接處有淡黃色暈圈，并使嫩枝梢枯，病害嚴重時可造成樹冠光禿、枝干腐爛，個體生長勢衰弱，林分蓄積量下降，嚴重阻礙桉樹產業發展[4]。前期研究發現，引起福建省桉樹焦枯病病害發生的主要病原主要有 Ca.kyotensis、Ca.pseudocolhounii、Ca.pseudoreteaudii[7]，其中Ca.pseudoreteaudii YA51為致病性強的優勢種。

植物的病原學研究以及抗病性鑒定等工作的重要環節之一是誘導促使真菌產生分生孢子[9]。通常促進分生孢子產生的方法主要有近紫外光照射、菌落劃傷、菌絲涂斷、更換培養基或在培養基中加入植物煎汁或組織、某種營養成分等[9-16]。課題組前期對桉樹焦枯病菌研究中發現，Ca.pseudoreteaudii YA51在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 （potato dextrose agar medium，PDA）中產孢量少且菌絲旺盛，不利于后期進行孢子原生質體的制備以及農桿菌介導轉化試驗。隨著桉樹的大規模種植，桉樹焦枯病的危害日益加重[17]。如何通過人工的方式快速、高效的獲得大量孢子成為該病害研究的瓶頸。有鑒于此，本試驗以查彼德培養基（Czapek-Dox Medium）為基礎，添加不同組分旨在尋找促進Ca.pseudoreteaudii YA51高效產孢的培養基配方，為后續研究奠定堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用菌株分離自福建福州地區桉樹焦枯病病樣葉片，為實驗室期鑒定的為Ca.pseudoreteaudii YA51[7]。

1.2 培養基

（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar medium，PDA ），加水定容至 1 L[18]。

表1 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基Table 1 Potato glucose agar medium

（2）查彼特培養基（czapek-dox medium，Czapek），加水定容至1 L[18]。

表2 查彼特培養基Table 2 Chapel medium

（3）Czapek-Dox Medium+桉樹葉煎汁 （Czapek+ELA），Czapek-Dox Medium中以3 g桉樹葉煮沸的煎汁取代純水。

（4）Czapek-Dox Medium+桉樹葉煎汁+維生素 B1+維生素 B6（CzapekE+VB1+VB6）

（5）Czapek-Dox Medium+ 南美蟛 蜞 菊 （Wedelia trilobata（L.）Hitchc.）煎汁（Czapek+WTLA），其中以 3 g蟛蜞菊葉片煮沸的煎汁代替純水。

（6）Czapek-Dox Medium+桉樹葉煎汁+維生素 B1（CzapekE+VB1），設置維生素 B1的濃度梯度為 0.10、0.20、0.30、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、3.00、4.00、5.00 g·L-1。

各培養基110 kpa,121℃滅菌20 min，備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基對Ca.pseudoreteaudii YA51生長的影響

將菌株接種于PDA培養基中，置于黑暗條件下，28℃恒溫培養10 d，待菌落長至培養皿邊緣時，用接種針挑取邊緣新鮮菌絲，分別接種與上述（1.2培養基）不同平板（直徑9 cm）中央，黑暗無光，28℃培養7 d[9]。測量菌落直徑，觀察并比較不同培養基之間菌落特征以及生長速度的異同。以PDA培養基作為對照。每種培養基重復3皿。

1.3.2 培養基對Ca.pseudoreteaudii YA51產孢和孢子萌發率的影響

接菌方式與培養條件和1.3.1相同。培養7 d后，先用移液槍槍頭輕輕刮掉菌絲，再以2 mL無菌水清洗全皿，并用槍頭輕輕刮洗培養皿表面，并反復用菌液清洗，確保分生孢子沒有粘附在培養基上，吸取200μL置于血球計數儀板上計算和統計單位菌落面積的產孢量。以PDA培養基為對照。每種培養基重復3皿。

1.4 數據處理

利用SPSS和Excel對試驗數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對菌落形態、生長的影響

不同培養基對菌株直徑具有一定影響，其中CzapekE+VB1的平均直徑最小，為4.2 cm，CzapekE+VB1+VB6最大直徑為6.42 cm。PDA直徑居中（圖1）。說明復合維生素營養有宜菌落直徑的生長。由圖2可看出，不同培養基對菌落形態影響較大，PDA和CzapekE+VB1+VB6菌絲厚重，且菌落周邊偏白，中央區域呈現淡褐色，但產孢較少，說明營養物質豐富，有利于菌絲生長。Czapek和Czapek+WTLA菌落呈現深褐色，菌絲較稀疏，其中Czapek有菌株老化的趨勢，且產孢不明顯，表明營養匱乏，僅能維持菌落基本生長，無法為后期生長提供充足養分。Czapek+ELA和Czapek+VB1菌落整體顏色偏白。CzapekE+VB1可明顯看出產孢區，菌絲稀疏。因此，以上試驗結果說明在可維持基本生長的Czapek基礎上，CzapekE+VB1+VB6菌絲過勝，不利于后期分生孢子液的制作，CzapekE+VB1的組合菌絲稀少，且具有促進產孢的作用。

圖1 不同培養基對Ca.pseudoreteaudii YA51直徑的影響Figure 1 Effects of different culture media on mycelial growth of Ca.pseudoreteaudii YA51

圖2 不同培養基對Ca.pseudoreteaudii YA51形態和直徑的影響Figure 2 Effects of different culture media on mycelial growth and shape of Ca.pseudoreteaudii YA51

2.2 不同培養基對產孢和孢子萌發率的影響

Czapek+ELA 、CzapekE+VB1、CzapekE+VB1+VB6、Czapek+WTLA均對菌株產孢有促進作用，產孢量依次為 1.33×106、1.17×106、7.00×105、1.43×106個/mL，分別為對照組的2倍、2倍、1倍、3倍。但不同培養基對孢子萌發率影響不大，萌發率均在95%以上，表明不同組分不會造成菌落突變或死亡。

圖3 不同培養基對Ca.pseudoreteaudii YA51產孢和孢子萌發的影響Figure 3 Effects of different culture media on sporulation and conidia germination of Ca.pseudoreteaudii YA51

2.3 不同濃度維生素B1對菌落形態、生長速度的影響

對VB1促進產孢最佳濃度篩選試驗表明。不同濃度VB1對菌落直接影響不大（圖4），但菌落形態有明顯差異（圖5）。添加桉樹葉煎汁和VB1的菌落菌絲稀疏，肉眼可以明顯觀察到產孢區。然而，隨著濃度的增加，菌落中間黃色區域明顯變多，可見產孢區減少，有衰老趨勢，因此，高濃度VB1對于Ca.pseudoreteaudii YA51具毒害作用。

圖4 不同維生素B1濃度對Ca.pseudoreteaudii YA51直徑的影響Figure 4 Effects of different vitamin B1’s concentration on mycelial growth of Ca.pseudoreteaudii YA51

圖5 不同維生素B1濃度對Ca.pseudoreteaudii YA51形態和直徑的影響Figure 5 Effects of different vitamin B1’s concentration on mycelial growth and shape of Ca.pseudoreteaudii YA51

2.4 不同濃度維生素B1對產孢和孢子萌發率的影響

隨著VB1濃度的增加，產孢量和孢子萌發率的趨勢為先增加后減少（圖6），在VB1濃度為0.4 g·L-1時達到巔峰，產孢量為3.23×106個/mL，是對照組的6倍，自0.4 g·L-1高峰后，產孢量極速下降，孢子萌發率也隨著濃度的增高而降低，因此，高濃度VB1對Ca.pseudoreteaudii YA51有抑制作用，最適產孢VB1濃度為 0.4 g·L-1。

圖6 不同維生素B1濃度對Ca.pseudoreteaudii YA51產孢量和孢子萌發率的影響Figure 6 Effects of different vitamin B1’s concentration sporulation and conidia germination of Ca.pseudoreteaudii YA51

3 小結與討論

Ca.pseudoreteaudii YA51在PDA培養過程中，一般需要10 d才會大量產孢，且產孢量低，無法滿足1.00×106個/mL的需求[19-20]。本試驗中，在Czapek的基礎上添加桉樹葉煎汁和VB1可在培養7 d時達到1.00×106個/mL，既節約了時間，又滿足試驗需求量。

草莓炭疽病菌 （Colletotrichum theobromicola）、葡萄潰瘍病菌（Botryosphaeria dothidea）等采用涂斷菌絲或者刮傷菌落的方法進而促進產孢[9,21-23]，但此類方法不適宜Ca.pseudoreteaudii YA51，本菌株在PDA培養基過程中易被青霉菌（Penicillium）污染，刮傷菌落后再培養，極大的增加了污染率。雖然在PDA基礎上添加葉片煎汁等也可達到提高產孢量的作用[24]。但Ca.pseudoreteaudii YA51因營養物質的變化可引起可觀的形態改變，我們在培養Ca.pseudoreteaudii YA51中發現，不同批次的PDA中菌落形態也有差異，這是由于不同批次土豆的營養物質含量不同。

為了避免非可控因素，本試驗采用主要營養物質成分來源明確的Czapek培養基，通過自主改變其中某種元素進而達到改變菌落形態的目的。添加桉樹葉煎汁的目的在于模擬和提供自然環境下菌株的生長環境。本試驗結果表明，Czapek+ELA產孢量為1.33×106個/mL，確有提高產孢量的作用，在其基礎上再添加VB1可進一步提高產孢量，最高可達3.23×106個/mL。何書婷等2017年發現入侵植物對某些真菌具有抑制作用[25]，其中相關研究表明蟛蜞菊不僅可抑制植物生長，也對致病真菌菌的生長和活力具一定影響[26-28]。因福建本省南美蟛蜞菊居多，參照桉樹葉煎汁的方式嘗試南美蟛蜞菊煎汁，發現可以促進Ca.pseudoreteaudii YA51產孢，此方法原材料豐富，成本廉價，操作簡單。

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