寒蘭菌根的顯微結(jié)構(gòu)與菌根真菌的分離

李國平，楊鷺生，李 娟

（武夷學院 生態(tài)與資源工程學院，福建 武夷山 354300）

在自然條件下,蘭科植物的根與土壤中的真菌共生形成典型的菌根結(jié)構(gòu)。菌根真菌不僅在蘭科植物的種子萌發(fā)過程發(fā)揮重要作用，而且為植株提供碳水化合物和礦物質(zhì),增加抗逆性，促進蘭科植物的生長發(fā)育[1]。蘭科菌根的形成可分為2個時期，一是在蘭科植物種子萌發(fā)時，菌根真菌對種子的侵染；二是在胚芽形成幼根之后，菌根真菌對新根的侵染。相關(guān)研究表明[2-4]，菌根真菌侵染新根有2種方式，一種情況是根被不具通道細胞，菌根真菌通過破壞根被細胞而直接侵入皮層組織，進而形成內(nèi)生菌根,如墨蘭和建蘭；另一種是通過根被上的通道細胞侵入根皮層組織進而形成內(nèi)生菌根，如春蘭、密花石斛、西藏虎頭蘭等。但是，高瑾等[5]觀察了春蘭等4種地生蘭的菌根形成過程，在春蘭根被細胞中并未看到通道細胞，菌絲入侵的方式是通過破壞根被細胞而入侵的。

寒蘭為蘭科蘭屬植物，與春蘭、建蘭和墨蘭等均屬于我國國蘭，主要分布于我國福建、浙江、江西、湖南、廣東、廣西、四川、貴州和云南等地[6]，其葉姿飄逸，花亭與葉等高或高出葉，花色艷麗豐富，常有濃烈香氣，花期常集中在10月至11月開花，深受國人喜歡。近年來，由于野生寒蘭遭受亂采濫挖，資源急劇減少。寒蘭的種子多且細小，發(fā)育不完全，種子育苗的難度極大。播種育苗過程中需要篩選適宜的菌根真菌與其共生，胚才能正常的發(fā)芽生長。寒蘭的傳統(tǒng)繁殖方式是分株繁殖，但繁殖系數(shù)低。理論上可利用組培技術(shù)進行寒蘭的快速大規(guī)模繁殖[7]，但要真正解決寒蘭的快速繁殖還有許多問題需要解決，首要問題之一就是組培苗菌根化的問題，因其缺少共生菌根致使組培苗移栽成活率低，幼苗生長緩慢。目前,未見關(guān)于寒蘭菌根結(jié)構(gòu)及菌根真菌的研究報道。本研究以武夷山野生寒蘭為材料，通過采用徒手切片法和苯胺藍染色壓片法，并借助光學顯微鏡對寒蘭菌根進行觀察，對其內(nèi)生真菌進行分離培養(yǎng)、鑒定，以期為寒蘭與其菌根真菌的共生關(guān)系研究和有益菌株的篩選奠定基礎(chǔ)，為今后開展寒蘭的快速繁殖和人工栽培技術(shù)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生成年寒蘭，帶花果，采自武夷山山區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 菌根顯微結(jié)構(gòu)觀察

1.2.1.1 苯胺藍染色壓片的制作

參考喬元寶[8]方法觀察菌根真菌侵染情況：選取寒蘭健康的新鮮營養(yǎng)根，剪成3 cm的小段，加入10%KOH于85℃下水浴30 min，自然冷卻后滴加30%H2O2溶液處理10 min，之后沖洗根樣至流出的水無顏色，再以10%HCl溶液處理5 min，加0.05%苯胺藍乳酸溶液染色30 min。根樣保存于85%乳酸溶液中備用。觀察時取出根樣，制作成臨時裝片，于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.1.2 徒手切片的制作

選取寒蘭健康的新鮮營養(yǎng)根，洗凈，徒手切片，不染色或經(jīng)番紅-固綠染色法染色后在光學顯微鏡下觀察菌根的結(jié)構(gòu)特點并拍照。

1.2.2 菌根真菌的分離與鑒定[9-11]

1.2.2.1 菌根真菌的分離純化

剪切寒蘭新鮮、健康營養(yǎng)根，清洗后在超凈工作臺上用0.1% 升汞處理3～5 min，無菌水蕩洗5～6次，切成3～5 mm的薄片，接種到PDA平板上，每皿4～5片，37℃恒溫避光培養(yǎng)，待接種后的平板上形成一定大小的菌落后，從其邊緣挑取菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA平板。重復以上操作，直至獲得純種菌落。將純化菌株轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，25℃下培養(yǎng)48 h，置于4℃冰箱中保存。

1.2.2.2 內(nèi)生真菌的鑒定

將分離到的純種菌根真菌，挑取少量菌絲畫線于新的PDA培養(yǎng)基平板上，25℃恒溫避光培養(yǎng)，待菌落長好后，觀察并記錄菌落形狀、大小、邊緣、正背面顏色、色素、氣味等特征，作為表型鑒定分類依據(jù)。

產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)誘導：將分離到的純種菌根真菌，挑取適量菌絲接種于麥麩糖培養(yǎng)基上，用鑷子夾起無菌的蓋玻片45°斜插入培養(yǎng)基中，在25℃恒溫暗培養(yǎng)，待菌絲長滿平皿后,轉(zhuǎn)移至4℃冰箱，待4～6個月后鏡檢。

插片培養(yǎng)法：將無菌的蓋玻片斜插入PDA培養(yǎng)基內(nèi)，待菌絲布滿蓋玻片時，取出直接鏡檢，或蓋到滴加一滴乳酸酚棉藍染色液的載玻片上，封片后鏡檢，可觀察菌絲在自然生長狀態(tài)下的特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 寒蘭菌根顯微結(jié)構(gòu)

寒蘭根較粗壯,直徑為0.3～0.7 cm。新生根為乳白色，根尖為白色，后逐漸變成棕褐色，無根毛，根表皮上有少數(shù)棕褐色的凹陷小孔。寒蘭菌根結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)依次是根被、皮層和中柱（維管柱）（圖1）；內(nèi)皮層由單層細胞組成，細胞較小，近圓形，排列緊密整齊；中柱最外圍具中柱鞘，韌皮部與木質(zhì)部交替分布，中間為髓部（圖2）。菌根的根被是由幾層緊密排列的厚壁細胞組成（圖 3）。

圖1 寒蘭菌根橫切結(jié)構(gòu)（×10）VE.根被；EX .外皮層；CO .皮層；ST.中柱；PE.中柱鞘；PI.髓Figure 1 Corrhizal microstructure of Cymbidium kanran（×10）VE.Velamen；EX.Exodermis；CO.Cortex；ST.Stele；PE.pericycle；PI.Pith

圖2 寒蘭菌根結(jié)構(gòu)（×40）CO.皮層；EN.內(nèi)皮層；PE.中柱鞘；ST.中柱；PI.髓Figure 2 Mycorrhizal microstructure of Cymbidium kanran（×40）CO.Cortex；EN.Endodermis;PE.pericycle；ST.Stele；PI.Pith

圖3 寒蘭菌根結(jié)構(gòu)（×10），示根被VE.根被；CO .皮層Figure 3 Mycorrhizal microstructure of Cymbidium kanran,showing the velamen（×10）VE.Velamen；CO .Cortex

寒蘭新根表面可觀察到著色較深的部位，老根上有少數(shù)棕褐色的凹陷小孔，為菌根真菌的侵入點。根被層未觀察到通道細胞，而通過苯胺藍染色壓片法觀察發(fā)現(xiàn)，在根被細胞中有發(fā)達的菌絲團（圖 4），菌絲具有明顯的橫隔（圖5），觀察結(jié)果表明：寒蘭的菌根真菌的入侵的主要方式是破壞寒蘭的根被組織，進而侵染皮層細胞，形成內(nèi)生菌根。

圖4 菌根根被細胞中具菌絲（×40）H.菌絲；VE.根被Figure 4 Microscopic observation of hyphae in the velamen cell（×40）H.Hyphae;VE.Velamen

圖5 示根被細胞內(nèi)菌絲具橫隔（×40）H.菌絲；T.橫隔Figure 5 Showing the septate hypha of mycorrhizal fungi in the velamen cell（×40）H.Hyphae;T.Tabula

寒蘭菌根皮層由二十層左右的排列不規(guī)則的薄壁細胞組成，占菌根橫切面的一大部分。在老根皮層的薄壁細胞中，分布著大量的菌絲及菌絲團。在菌絲團形成之初,結(jié)構(gòu)松散，菌絲較細，頂端呈觸須狀，可繼續(xù)侵染下一個細胞（圖6，7），菌絲團形成中后期，菌絲會繼續(xù)膨大而形成的致密的菌絲團，結(jié)構(gòu)也變得更為致密，幾乎看不見菌絲（圖8）。

在根尖中的皮層細胞中沒有發(fā)現(xiàn)菌絲團，但在新生根的根被中有少量菌絲存在；在根被中僅有菌絲，沒有成型的菌絲團；在維管柱中既沒有成型的菌絲團，也沒有松散的菌絲。

圖6 示皮層細胞內(nèi)菌絲團（×40）Figure 6 Showing the hypha group in the cortex cell（×40）

圖7 示皮層細胞內(nèi)菌絲團（×40）H.菌絲團Figure 7 Showing the hypha group in the cortex cell（×40）H.Hypha group

圖8 示皮層細胞內(nèi)致密的菌絲團（×40）Figure 8 Showing the compact hyphae in the cortex cell（×40）

2.2 寒蘭菌根真菌分離結(jié)果

通過常規(guī)分離、純化培養(yǎng)，自寒蘭新鮮營養(yǎng)根中共分離到真菌菌株36個；依據(jù)其菌落形態(tài)和菌絲的顯微形態(tài)特征進行初步鑒定，36個真菌菌株隸屬于10個屬，其中7個屬為帚霉屬（Eptographium）、絲核菌屬 （Rhizoctonia）、叢梗孢屬 （Monilia）、色二孢屬（Diplodia）、 木 霉 屬 （Trichoderma）、 鐮 刀 菌 屬（Fusarium ）和角菌根菌屬（Ceratorhiza）（圖 9-15），其它3個屬的分類位置尚不能確定。

圖9 帚霉屬Eptographium sp.培養(yǎng)特征 a.菌落；b.菌絲F igure9 Colony characteristicsof Eptographium sp.a.Colony；b.hypha

圖10 絲核菌屬Rhizoctonia sp.培養(yǎng)特征 a.菌落；b.菌絲F igure10 Colonycharacteristicsof Rhizoctonia sp.a.Colony；b.hypha

圖11 叢梗孢屬Monilia sp.培養(yǎng)特征 a.菌落；b.菌絲Figure 11 Colony characteristics of Monilia sp.a.Colony；b.hypha

圖12 色二孢屬Diplodia sp.培養(yǎng)特征 a.菌落；b.菌絲F igure12 Colony characteristicsof Diplodia sp.a.Colony；b.hypha

圖13 木霉屬Trichoderma sp.培養(yǎng)特征 a.菌落；b.菌絲Figure 13 Colony characteristicsof Trichoderma sp.a.Colony；b.hypha

圖14 鐮刀菌屬Fusarium sp.培養(yǎng)特征 a.菌落；b.菌絲F igure14 Colony characteristicsof Fusarium sp.a.Colony；b.hypha

圖15 角菌根菌屬Ceratorhiza sp.培養(yǎng)特征 a.菌落；b.菌絲Figure 15 Colony characteristics of Ceratorhiza sp.a.Colony；b.hypha

3 討論

通過組織切片法觀察了寒蘭根的顯微結(jié)構(gòu)，寒蘭根橫切結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)依次是根被、皮層和中柱 （維管柱），具內(nèi)皮層，中柱具中柱鞘和髓部，結(jié)果表明寒蘭根的顯微解剖特征為典型的蘭科植物根結(jié)構(gòu)，與春蘭、建蘭、墨蘭及獨花蘭等蘭科植物的根結(jié)構(gòu)相似[2,12-14]。通過苯胺藍染色方法觀察了菌根真菌在寒蘭根中的侵染和分布情況，在根被層和皮層細胞中可觀察到菌絲團的分布，證明了寒蘭在自然界是與菌根真菌共生的，而形成的典型菌根結(jié)構(gòu)；新生根或者根尖細胞內(nèi)無菌根真菌分布，成熟根的內(nèi)皮層、中柱和中柱鞘細胞內(nèi)亦未觀察到有菌絲分布；根被層未觀察到通道細胞，但有發(fā)達的菌絲團分布，由此可推測，寒蘭菌根真菌入侵的主要方式是通過破壞寒蘭的根被細胞,進而侵染皮層，在皮層細胞內(nèi)定植，形成內(nèi)生菌根。寒蘭菌根真菌的侵染方式與墨蘭[12]、建蘭[13]以及扇脈杓蘭[8]等的類似，同屬于無通道細胞的蘭根。有研究表明[2]，與寒蘭同屬的春蘭菌根則具有通道細胞，其菌根菌絲自外皮層薄壁通道細胞侵入皮層細胞。不過，真菌菌絲通過通道細胞侵染的方式多見于附生蘭科植物，如密花石斛、卡特蘭和西藏虎頭蘭等[3-4]。

研究采集寒蘭新鮮營養(yǎng)根進行內(nèi)生真菌的分離、純化培養(yǎng)，依據(jù)形態(tài)特征歸類后共得到36個真菌菌株純培養(yǎng)，并根據(jù)菌落形態(tài)、菌絲特征和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)進行初步鑒定，36個真菌菌株分屬帚霉屬、絲核菌屬、叢梗孢屬、色二孢屬、木霉屬、鐮刀菌屬、角菌根菌屬等10個屬。由于蘭科植物菌根真菌多缺乏穩(wěn)定的形態(tài)學和培養(yǎng)特征，產(chǎn)孢誘導又往往不易成功，有的真菌本身并沒有產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，故單從形態(tài)學方面很難準確鑒定。近年來，人們普遍采用真菌的分子特征作為分類依據(jù)，分子鑒定可以從遺傳進化的角度對真菌的種類、系統(tǒng)地位以及相互間的親緣關(guān)系等做出判定,有效地提高了真菌鑒定的科學性和準確性[15-16]。本研究主要采用了經(jīng)典的形態(tài)學鑒定方法，所分離到的36個真菌菌株的確切分類位置有待利用分子生物學手段進行進一步的分子鑒定。

真菌在蘭科植物的種子萌發(fā)階段及其以后的生長發(fā)育中均發(fā)揮重要的作用。與蘭科植物根共生的真菌具有專一性特點，同時，同一種蘭科植物中的菌根真菌又具多樣性[17]。由于寒蘭野生資源日趨枯竭，開展寒蘭組織培養(yǎng)和快速繁殖研究是保護寒蘭種質(zhì)資源的重要技術(shù)手段之一。為了提高寒蘭組培苗的馴化移栽成活率，以后應(yīng)加強寒蘭菌根中內(nèi)生真菌的分離鑒定以及有益菌株的篩選工作，以期為實現(xiàn)寒蘭工廠化育苗目標奠定基礎(chǔ)。

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