基于二維相關紅外光譜強酸性電解水對三種食源性致病菌的滅菌機制

林艷寧,陶寧萍,盧瑛,趙勇*,許長華*

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基于二維相關紅外光譜強酸性電解水對三種食源性致病菌的滅菌機制

林艷寧1,2,3,陶寧萍1,2,3,盧瑛1,2,3,趙勇1,2,3*,許長華1,2,3*

1. 上海海洋大學食品學院, 上海 201306 2. 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心, 上海 201306 3. 農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室, 上海 201306

本研究旨在利用二維相關紅外光譜結合紅外光譜差減法探究強酸性電解水（Acidic electrolyzed water，AEW）殺滅食源性致病菌的分子作用機制。經AEW處理后的三種常見食源性致病菌（副溶血性弧菌、沙門氏桿菌、單增李斯特菌），以其和電解水接觸時間為微擾條件，分析其和電解水接觸過程中光譜動態變化過程，獲取電解水處理對其相應化學基團的干擾信息。結果顯示，AEW使致病菌蛋白質二級結構發生改變，使折疊含量逐漸增高，轉角含量逐漸降低。本研究為以后利用光譜技術揭示電解水滅菌分子機制奠定了基礎。

強酸性電解水; 食源性致病菌; 二維相關紅外光譜; 滅菌機制

近年來由食源性致病菌引起的食品安全問題已經成為全世界所面臨的一個巨大威脅和挑戰。存在于水產品中的副溶血性弧菌、單增李斯特菌、沙門氏桿菌等致病菌是引起世界包括中國在內的食源性疾病的主要致病菌[1,2]。為了給消費者生產高質量、微生物安全的食物，很多滅菌方法被應用于食品工業的器械、原材料中來保持商業無菌。在眾多滅菌方法中，以低pH(2~3)、高氧化還原電位(900~1200 mV)、高活性氧(10~160 mg/L)為特征的AEW[3]正好滿足了食品工業中的滅菌需求。AEW對食品中不同的致病菌都具有良好的滅菌效果，具有廣譜滅菌，操作簡便，環境友好等優點。目前，AEW已被廣泛地應用于研究和生產當中。然而，有關于AEW的滅菌機制仍然未被完整揭示。揭示AEW的滅菌機制對于將其更好的應用到食品工業，甚至是其它工業的滅菌中具有重要作用。

研究證明，影響AEW殺菌能力的因素有很多：AEW中過低的pH環境嚴重擾亂細菌表面的兩性物質，增加細胞膜滲透性，并且妨礙新陳代謝過程[4]；過高的氧化還原電位改變細菌細胞內電子流，影響細胞內能量代謝和ATP合成[4,5]；AEW中含有活性氧的成分能引起細胞內關鍵蛋白質折疊，從而影響細胞對電解水的耐受性[6]。然而，很少有研究從揭示AEW和細菌作用時細菌大分子物質化學結構變化的角度來闡述AEW滅菌機制。這些結構變化對于揭示AEW滅菌機制起著至關重要的作用。二維相關紅外光譜分析方法，通過對光譜變化分析，可得到分子內官能團間相互作用和分子間相互作用信息。差譜方法利用混合樣品光譜減去基準物質光譜，可得到目標物質光譜，降低了光譜中由其它物質帶入的干擾[7]。

本研究利用二維相關紅外光譜結合紅外光譜差減方法，從生物大分子結構改變的角度揭示AEW對食源性致病菌的滅菌機制，為AEW滅菌機制研究開辟一種新思路。

1 材料方法

1.1 致病菌樣品制備

實驗所用三種食源性致病菌標準菌株，副溶血性弧菌(ATCC17802)，單增李斯特菌(ATCC19115)，沙門氏桿菌(CMCC50041)。標準菌株用25%的甘油保存管保存于-80 °C冰箱備用。用TSB培養基(TSB，北京市陸橋科技有限公司，中國)在37 °C下培養致病菌18~20 h，使菌株活化后，按1%接菌量將100 μL致病菌接種到10 mL TSB液體培養基中，在37 °C下培養10 h，使致病菌生長到對數期。在3000 g，25 °C條件下用離心機(Centrifuge 5417R，Eppendorf，德國)離心10 min，將液體培養基中的菌體富集。富集到的菌體沉淀分別用超純水清洗3次，留下菌體沉淀備用。

1.2 電解水制備

參照之前的研究制備AEW[8]。AEW在電解水生成裝置(FW-200，AMANO，日本)中生成，利用電解池的陽極電解0.15%的氯化鈉溶液15 min產生AEW。制備出的AEW的pH和氧化還原電位(ORP)用pH/ORP測量儀(Mettler-Toledo, Zurich,瑞士)進行測量。有效氯濃度(ACC)通過比色法，用數字氯檢測試劑盒(RC-2Z,笠原化工儀器有限公司，日本)來測定。所有操作做三組平行。最終制備的AEW pH值為2.15，ORP為1171.9，ACC為0.0074%。

1.3 實驗儀器設備以及實驗條件

紅外光譜儀為美國Thermo Scientific Nicolet公司生產的iS5光譜儀，采用DTGS檢測器。掃描次數為16次，分辨率為4 cm-1，掃描范圍為4000~400 cm-1。H2O和CO2的干擾在掃描中被扣除。用電解水與細菌混合后的樣品光譜減去純電解水的光譜，以3400 cm-1[9]為參照峰，差減因子為0.9932，獲取細菌樣品和電解水接觸后的動態光譜。采用Perkin-Elmer公司spectrum v3 02操作軟件獲取樣品二階導數圖譜。

二維相關紅外光譜（2DCOS-IR）的獲取：將上述處理好的AEW加入ATR(Attenuated Total Reflection)附件中，先采集AEW的紅外光譜，隨后再分別采集三種食源性致病菌的紅外光譜記錄為0 s時的光譜。將三種食源性致病菌沉淀與電解水混合，并開始計時，每隔30 s采集一次紅外光譜，直到3.5 min后停止采集。二維紅外相關光譜通過二維紅外光譜分析軟件(Nicolet iN10 SpectraCorr)分析獲得。

2 結果和討論

2.1 AEW處理過程中三種致病菌的紅外光譜分析

三種食源性致病菌(單增李斯特菌，沙門氏桿菌，副溶血性弧菌)的紅外光譜差譜如圖1所示，其特征峰總結列于表1[10-13]。

1800~1100 cm-1包含了紅外光譜的特征區域和指紋區域，可以用來鑒別檢測AEW殺滅食源性致病菌過程中化學分子發生的動態變化。由圖1可知，隨著與AEW接觸時間增加，三株菌在1800~1100 cm-1范圍內表現出差異。特別是以1237 cm-1做歸一化后，三株菌在特征峰1085 cm-1(Cellular proteins)、1398 cm-1(s(CH3))、1455 cm-1(s(C-O-H))處信號強度在從0~210 s過程中逐漸降低。這反映出，致病菌在AEW處理過程中，蛋白質結構逐漸發生改變，細胞壁脂類結構也逐漸發生變化。

圖 1 三種食源性致病菌經AEW處理3.5 min之內的傅里葉紅外光譜

(A）丹增李斯特菌；(B）沙門氏桿菌；(C）副溶血性弧菌

表1 三種食源性致病菌紅外譜特征譜帶指認

2.2 AEW處理過程中三種致病菌的紅外光譜二階導數分析

紅外光譜二階導數圖譜可以分開原始圖譜中重疊的吸收峰和寬峰，增加光譜分辨率，放大原始圖譜中的細微差別[14,15]。如圖2所示，隨著食源性致病菌和AEW接觸時間增加，蛋白質中β折疊的特征峰（1694 cm-1）[13]吸收強度逐漸增強。β轉角的特征峰（1687 cm-1）[13]信號強度逐漸降低。副溶血性弧菌和沙門氏桿菌蛋白質中苯基C-C振動（1589 cm-1）[16]逐漸降低，單增李斯特菌中逐漸升高。這證明在電解水和食源性致病菌相接觸過程中，電解水使細菌蛋白質二級結構發生變化。

圖 2 三種食源性致病菌經AEW處理3.5 min之內的紅外光譜（1700~1550 cm-1）二階導數圖譜

(A）丹增李斯特菌；(B）沙門氏桿菌；(C）副溶血性弧菌

對AEW處理0~210 s對應致病菌的酰胺I帶（1600~1700 cm-1）光譜進行曲線擬合分析，獲取在此過程中，致病菌蛋白質二級結構的動態變化量[13]。丹增李斯特菌與AEW接觸時間從0 s到210 s這一過程中蛋白質二級結構的曲線擬合結果如圖3所示。隨著和AEW接觸時間的增加，蛋白質折疊的含量從45.79%逐漸增加到54.33%，轉角的含量從16.51%逐漸減小到12.1%(表2)。沙門氏桿菌與副溶血性弧菌也呈現出同樣的變化規律，這證明，在致病菌和AEW接觸過程中AEW逐漸破壞致病菌蛋白質二級結構中的折疊和轉角。

圖 3 單增李斯特菌經AEW處理3.5 min之內酰胺I帶（1700~1600 cm-1）處的紅外光譜曲線擬合圖

(a) 0 s，(b) 30 s，(c) 60 s，(d) 90 s，(e) 120 s，(f) 150 s，(g) 180 s，(h) 210 s

表 2 單增李斯特菌經AEW處理3.5 min之內的蛋白質二級結構含量

2.3 AEW處理過程中三種致病菌的二維相關紅外光譜分析

圖 4 三種食源性致病菌經AEW處理3.5 min之內在1400~1600 cm-1范圍內的二維相關紅外光譜

Fig.4 Two-dimensional correlation infrared spectroscopy of three food-borne pathogenic bacteria with AEW treatment within 3.5 min in the region of 1400~1600 cm-1

(A）丹增李斯特菌；(B）沙門氏桿菌；(C）副溶血性弧菌

使用二維相關紅外光譜可以觀察到食源性致病菌對AEW擾動的響應，獲得比普通紅外光譜更多的信息，增強譜圖分辨率。由圖3中可見，在從0~210 s的逐漸增時過程中，三種致病菌在1600~1400 cm-1內的二維相關紅外光譜在1560 cm-1（ring base）、1636 cm-1（sheet）[10]處有強自動峰，在1419 cm-1（Vs(COO-)）、1406 cm-1（as(CH3)）[11]處有比較弱的自動峰(圖3 A)。在1489 cm-1（V（CH））、1480 cm-1（AmideⅡ）、1472 cm-1（CH2）[13]處有強自動峰，1456 cm-1（δas(CH3)）、1435 cm-1（δ（CH2））、1418 cm-1（Vs(COO-)）[11]處有弱的自動峰（圖3 B）。在1571 cm-1（AmideⅡ）、1550 cm-1（AmideⅡ）、1540 cm-1（AmideⅡ）[13]處有強的自動峰，在1565 cm-1（ring base）[13](圖3 C)處有弱的自動峰。在和AEW接觸的過程中蛋白質受到的擾動最大，尤其是苯基的響應最大，這證明蛋白質結構受到的破壞最顯著。除此之外，脂類亞甲基，多糖類等也出現相應的自動峰，即致病菌中的脂類和多糖類也遭到破壞。

3 結論

隨著三種食源性致病菌與AEW接觸時間增加，利用紅外光譜差譜結合二維相關紅外光譜方法，可以檢測到致病菌從存活到死亡過程中對應的光譜變化。從原始圖譜到二階導數圖譜，再到二維相關紅外光譜，樣品圖譜的分辨率逐級提高。原始圖譜與二階導數圖譜均得出致病菌在和電解水作用過程中其蛋白質二級結構發生變化，即β折疊含量逐漸增高，轉角含量逐漸降低。二維相關紅外光譜證明，其蛋白質的苯基等官能團對電解水的響應最大，蛋白質的結構受到電解水的擾動最大，其次脂類，多糖類也出現響應，即AEW還破壞脂類和多糖類。本研究初步證明紅外光譜差譜結合二維相關紅外光譜方法可以用于研究電解水滅菌機制，同時這種方法有望以后用于研究生物體與外界環境的動態變化作用機制中。

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Sterilization Mechanism of AEW on Three Kinds of Food Borne Pathogenic Bacteria by Using Two Dimensional Infrared Correlation Spectroscopy

LIN Yan-ning1,2,3, TAO Ning-ping1,2,3, LU Ying1,2,3,ZHAO Yong1,2,3*, XU Chang-hua1,2,3*

1.201306,2.201306,3.201306,

The purpose of this study was to explore the molecular mechanism of killing foodborne pathogenic bacteria (AEW) in strongly acidic electrolytic water (Acidic electrolyzed water) by two dimensional correlation infrared spectroscopy (IR) and infrared spectral subtraction (IR). Three common foodborne pathogenic bacteria (and) treated with AEW were used as perturbation conditions to analyze the dynamic changes of spectrum during contact with electrolytic water. The interference information of electrolytic water treatment on the corresponding chemical groups was obtained. The results shown that AEW changed the secondary structure of protein, increased the content of β -fold and decreased the content of β -corner. This study laid a foundation for revealing the molecular mechanism of electrolytic water sterilization by spectral technique.

Acidic electrolyzed water (AEW); food-borne pathogenic bacteria; two dimensional correlation infrared spectroscopy; sterilization mechanism

Q93-334

A

1000-2324(2018)03-0424-05

2016-11-07

2016-12-22

中國國家自然科學基金(31401571); 上海市科技興農重點攻關項目(滬農科攻字(2016)第4-4號); 上海市科學技術委員會部分地方院校能力建設項目(15320502100); “十二五”國家科技支撐計劃重大項目(2015BAD17B01,2015BAD17B02)

林艷寧(1990),女,碩士研究生,主要從事紅外光譜拉曼光譜檢測研究. E-mail:yanninglinlin@163.com

Author for correspondence.E-mail:yzhao@shou.edu.cn; chxu@shou.edu.cn