辣椒疫霉效應(yīng)因子RxLR115890不同侵染時(shí)期的差異性表達(dá)

張麗,王儷穎,梁濤,丁鵬,朱彤彤,張修國(guó),李壯

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辣椒疫霉效應(yīng)因子RxLR115890不同侵染時(shí)期的差異性表達(dá)

張麗,王儷穎,梁濤,丁鵬,朱彤彤,張修國(guó),李壯*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 山東省蔬菜病蟲(chóng)生物學(xué)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 泰安 271018

辣椒疫霉菌（）能夠產(chǎn)生370多個(gè)RxLR效應(yīng)分子，絕大多數(shù)效應(yīng)分子的特性都是未知的。為了對(duì)辣椒疫霉RxLR效應(yīng)因子開(kāi)展深入的功能研究，本研究以辣椒疫霉SD33菌株的DNA為模板，設(shè)計(jì)辣椒疫霉菌以及RxLR115890的特異性引物。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RxLR115890在辣椒疫霉游動(dòng)孢子侵染條件下，不同時(shí)間的表達(dá)量。結(jié)果顯示，RxLR115890的表達(dá)量在侵染前期有明顯的上調(diào)表達(dá)，伴隨著侵染時(shí)間的加長(zhǎng)表達(dá)量迅速下降，又在12 h處再次輕微上調(diào)。由此得出結(jié)論，RxLR115890對(duì)辣椒疫霉菌的前期侵染具有至關(guān)重要的作用。為RxLR115890后續(xù)的研奠定了基礎(chǔ)。

辣椒疫霉; RxLR115890; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR; 表達(dá)量

辣椒疫霉（）是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上一類重要的植物病原卵菌，具有重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)與生態(tài)學(xué)的意義[1]。其寄主范圍廣，引起的作物疫病是作物生產(chǎn)上的毀滅性病害，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)還能侵染模式植物擬南芥和本氏煙，是卵菌研究的重要模式材料[2]。疫霉菌分泌大量的效應(yīng)分子，一類為胞間效應(yīng)分子，一類為胞內(nèi)效應(yīng)分子[3]，其中RxLR效應(yīng)分子是一類胞內(nèi)效應(yīng)分子，其能干擾寄主植物細(xì)胞的正常生理代謝和功能。由于卵菌多為二倍體，其遺傳學(xué)研究進(jìn)展較慢，直至2004年，Avr1b作為第一個(gè)克隆的卵菌效應(yīng)基因被報(bào)道[4]。目前已有十幾個(gè)卵菌效應(yīng)基因克隆和鑒定，均歸類于RxLR效應(yīng)蛋白家族序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，RxLR效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)上分為3部分：信號(hào)肽、N-端RxLR-dEER基序和C-端功能結(jié)構(gòu)域[5]，其中約為20個(gè)氨基酸長(zhǎng)短的信號(hào)肽可引導(dǎo)效應(yīng)蛋白進(jìn)入真核細(xì)胞，RxLR-dEER基序輔助成熟蛋白跨過(guò)寄主細(xì)胞膜進(jìn)入寄主細(xì)胞[5]，而C-端功能結(jié)構(gòu)域?qū)⑿?yīng)蛋白定位于胞內(nèi)靶標(biāo)位點(diǎn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能[6]。

1999年，首次被應(yīng)用于植物病理學(xué)研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是基于普通PCR，并將核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測(cè)等多項(xiàng)技術(shù)融合在一起的一項(xiàng)創(chuàng)造性技術(shù)，與常規(guī)PCR相比，其操作更簡(jiǎn)便，更快速，敏感性更強(qiáng)，重復(fù)性且特異性更好[7]。傳統(tǒng)的RT-PCR方法常被用于mRNA轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)，但此方法是非定量的[8,9]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號(hào)從而完成對(duì)起始模板定量及定性的分析[10]。其原理是在RT-PCR反應(yīng)中，引入一種化學(xué)熒光物質(zhì)[11]，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，其反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，相應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加，即熒光強(qiáng)度與監(jiān)測(cè)的產(chǎn)物量呈線性關(guān)系，最終得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品數(shù)量的檢測(cè)[12]。

在侵染條件下，辣椒疫霉通過(guò)提高或者降低自身分泌的效應(yīng)分子的表達(dá)量，來(lái)促進(jìn)對(duì)寄主的破壞作用[13,14]。本研究以辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR115890為研究對(duì)象，以實(shí)驗(yàn)室自交系辣椒以及辣椒疫霉為供試材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)在侵染狀態(tài)下115890在不同時(shí)間的表達(dá)量進(jìn)行分析，進(jìn)而研究RxLR115890在辣椒疫霉侵染時(shí)期的作用。研究結(jié)果為RxLR115890效應(yīng)分子的后續(xù)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試作物及菌株

供試作物：辣椒，品種為‘自交系’，實(shí)驗(yàn)室雜交預(yù)留。

供試菌株：所用菌株為辣椒疫霉菌株LT1534。是辣椒疫霉屬標(biāo)準(zhǔn)菌株，為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 菌株培養(yǎng)與DNA的提取

供試疫霉菌采用燕麥培養(yǎng)基進(jìn)行活化，3 d后挑取適當(dāng)大小的菌塊于液體V8培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)3~5 d，直至有菌絲球出現(xiàn)，三層紗布過(guò)濾收集菌絲，并液氮冷凍研磨，采用CTAB法提取菌絲的DNA，通過(guò)凝膠電泳驗(yàn)證，并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 材料準(zhǔn)備與RNA的提取

供試疫霉菌采用燕麥培養(yǎng)基進(jìn)行活化，培養(yǎng)7 d后去除培養(yǎng)基中部3~5塊0.5 cm見(jiàn)方的菌絲塊，用滅菌的山泉水每隔0.5~1.0 h清洗1次，共清洗7~8次。將處理后的培養(yǎng)皿置于14 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12~14 h，收集產(chǎn)出的游動(dòng)孢子懸浮液。辣椒種子經(jīng)表面消毒于25 ℃下催芽5 d，播種于裝有滅菌土壤的花盆中，置于22 ℃，相對(duì)濕度為90%條件下進(jìn)行光照培養(yǎng)，待辣椒植株長(zhǎng)到6葉期時(shí)進(jìn)行辣椒疫酶菌脅迫處理。采用離體孢子懸浮液接種，接種孢子懸浮液濃度為2×104個(gè)/mL。接種前將辣椒葉片進(jìn)行表面消毒，用接種針在葉片中間位置扎孔，并于接種前取辣椒疫霉菌絲（立即放入液氮速凍后，置-80 ℃超低溫冰箱保存）為對(duì)照材料，誘導(dǎo)材料每個(gè)葉片滴約10 μL孢子懸浮液，28 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，于接種后1.5、3、6、12、24、48、72 h分別取樣，液氮冷凍，并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將上述保存的辣椒樣品進(jìn)行液氮研磨，采用OMEGA植物RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作提取RNA，通過(guò)凝膠電泳驗(yàn)證RNA的完整性，并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 cDNA合成與純度、濃度檢測(cè)

以RNA為模板，參照諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，在冰上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系如下：4×g DNA wiper Mix 4 μL，模板RNA1 μg，RNase free ddH2O to 16 μL，42 ℃ 2 min；在第一步反應(yīng)管中直接加入5×HiScriptⅡqRT Super MixⅡ4 μL，第一步反應(yīng)液16 μL；50 ℃ 15 min，85 ℃5 s。用分光光度計(jì)檢測(cè)樣品的濃度與純度，并將cDNA的濃度稀釋到0.4 μg·μl-1，-20 ℃保存。

1.5 引物設(shè)計(jì)

NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中下載LT1534肌動(dòng)蛋白（）序列，登錄號(hào)為PPTG15376。應(yīng)用Primier Quest Tool（http://sg.idtdna.com/Primer Quest/Home/Index）軟件對(duì)其設(shè)計(jì)特異性熒光定量PCR引物。通過(guò)Blast program（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)所設(shè)計(jì)的引物序列與其它生物種屬之間的同源性及其引物二聚體的有無(wú)。引物由上海博尚基因公司合成后對(duì)特異性進(jìn)行篩選與評(píng)價(jià)。

應(yīng)用Primier Quest Tool（http://sg.idtdna.com/Primer Quest/Home/Index）軟件對(duì)RxLR115890特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性熒光定量PCR引物。通過(guò)Blast program（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)所設(shè)計(jì)的引物序列與其它生物種屬之間的同源性及其同源二聚體的有無(wú)。引物由上海博尚基因公司合成后對(duì)特異性進(jìn)行篩選與評(píng)價(jià)。

1.6 普通PCR檢測(cè)引物特異性

以辣椒疫霉菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。總體系為25 μL，其中2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃補(bǔ)充延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.7 熒光定量PCR篩選模板濃度

以辣椒疫霉菌基因組DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。測(cè)得基因組初始濃度為1.0 μg·μL-1，將樣品以十倍濃度進(jìn)行稀釋，獲得總濃度為1.0 μg·μL-1~1.0×10-6μg·μL-1，總體系為20 μL，其中2*Super Real Pre Mix Plus 10 μL，上下游引物各0.4 μL，DNA模板4 μL，50*ROX Reference Dye 0.4μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火32 s，共40個(gè)循環(huán)。在升溫時(shí)收集熒光信號(hào)，篩選cDNA的反應(yīng)濃度。

1.8 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以稀釋后的cDNA為模板，構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。反應(yīng)體系為2*Super Real Pre Mix Plus 10 μL，上下游引物各0.4 L，DNA模板4 μL，50*ROX Reference Dye 0.4μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。以模板DNA濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，反應(yīng)循環(huán)數(shù)(Ct)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取

提取高質(zhì)量的總RNA是進(jìn)行熒光定量PCR的關(guān)鍵。提取總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260／OD280值均在1.9~2.0之間，說(shuō)明所提取的總RNA純度較高，OD260／OD230值均在大于2.0，說(shuō)明提取的RNA沒(méi)有鹽離子污染。1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，總RNA的28S rRNA、18S rRNA兩條帶清晰銳利(圖1)，表明RNA未出現(xiàn)降解，完整性較好，并且沒(méi)有基因組DNA污染，符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。

圖 1 電泳檢測(cè)辣椒疫霉不同時(shí)期總RNA

2.2 普通PCR檢測(cè)引物特異性

以辣椒疫霉LT1534的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示，僅在辣椒疫霉菌的245 bp處有特異性條帶，無(wú)非特異性引物二聚體出現(xiàn)，說(shuō)明引物特異性良（2）。

圖 2 電泳檢測(cè)引物特異性

2.3 熒光定量PCR檢測(cè)引物特異性

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明：此引物對(duì)辣椒疫霉菌（編號(hào)為PPTG15376）模板DNA擴(kuò)增良好，溶解曲線有單一峰值，無(wú)非特異性擴(kuò)增及引物二聚體現(xiàn)象（如圖3-1，3-2）。

圖 3-1 RT-PCR檢測(cè)引物特異性-擴(kuò)增曲線

Fig.3-1 Detection of primer-specific by RT-PCR - amplification curve

圖 3-2 RT-PCR檢測(cè)引物特異性-溶解曲線

Fig.3-2 Detection of primer-specific by RT-PCR - Dissolution curve

2.4 熒光定量PCR篩選模板濃度

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明：此引物對(duì)辣椒疫霉菌(編號(hào)PPTG15376)模板DNA擴(kuò)增良好，且濃度為1 μg·μL-1~0.001 μg·μL-1時(shí)標(biāo)準(zhǔn)方差最小，因此cDNA濃度在此區(qū)間下最適宜。（如圖4-1，4-2）。

圖 4-1 RT-PCR篩選模板濃度-溶解曲線圖

Fig.4-1 RT-PCR screening template concentration-dissolution profile

圖 4-2 RT-PCR篩選模板濃度-表達(dá)量

Fig.4-2 RT-PCR screening template concentration -expression level

2.5 RxLR115890在不同辣椒疫霉菌侵染時(shí)期的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

RxLR115890在辣椒疫霉中的表達(dá)量是相對(duì)于辣椒疫霉中actin的表達(dá)量而確定的。以辣椒疫霉菌未侵染時(shí)期的RxLR115890作為對(duì)照，檢測(cè)不同侵染時(shí)期的辣椒疫霉菌的表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，RxLR115890在侵染時(shí)期的表達(dá)量明顯高于未侵染時(shí)期的，且在侵染前期表達(dá)量最高（如圖5-1，5-2）。

圖 5-1 RxLR115890熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

Fig.5-1 Real-time fluorescence quantitative standard curve of RxLR115890

圖 5-2 RxLR115890熒光定量PCR表達(dá)模式分析

Fig.5-2 Real-time fluorescence expression patterns of RxLR115890

3 討論

辣椒疫霉菌是一種重要的土傳病害病原菌，其寄主范圍較廣，可引起辣椒、番茄、黃瓜、南瓜等多種重要蔬菜作物的疫病。考慮到該病害的易爆發(fā)性，病原菌侵入植株后迅速蔓延，短時(shí)間內(nèi)即可暴發(fā)成災(zāi)，且其癥狀與傳統(tǒng)鐮刀菌引起的病害癥狀相似，在生產(chǎn)防治中難度較大，易給蔬菜生產(chǎn)造成毀滅性的災(zāi)害。

本研究基于辣椒疫霉菌在侵染條件下，菌絲體活躍程度的差異，在不同侵染時(shí)間檢測(cè)RxLR115890的差異性表達(dá)。設(shè)計(jì)辣椒疫霉actin以及RxLR115890特異性引物，以未侵染時(shí)期的辣椒疫霉未陰性對(duì)照，檢測(cè)RxLR115890在侵染時(shí)期的差異性表達(dá)。結(jié)果顯示，RxLR115890的表達(dá)量會(huì)在侵染時(shí)期明顯上調(diào)，且在3 h表達(dá)量達(dá)到頂峰，然后驟然下調(diào)，繼而再次輕微上調(diào)，最后平穩(wěn)下降。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在辣椒疫霉菌侵染辣椒寄主時(shí)，RxLR115890會(huì)調(diào)動(dòng)自身活性積極響應(yīng)，且在3 h時(shí)表達(dá)量最高，說(shuō)明RxLR115890在3 h時(shí)開(kāi)始對(duì)寄主起破壞作用，從而確定了RxLR115890的最佳研究時(shí)期，為互作的體內(nèi)驗(yàn)證時(shí)間選擇提供了數(shù)據(jù)支持，為RxLR115890功能研究奠定了理論基礎(chǔ)。本研究在生產(chǎn)實(shí)踐方面為分子檢測(cè)病害以及實(shí)時(shí)減藥防治辣椒病害技術(shù)提供了技術(shù)支持，同時(shí)在RNA水平確定了RxLR115890的表達(dá)趨勢(shì)，為致病分子遺傳機(jī)理與侵染時(shí)期的功能特性的研究提供了理論基礎(chǔ)。

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Differential Expression ofEffector RxLR115890 at Different Stages of Infection

ZHANG Li, WANG Li-ying, LIANG Tao, DING Peng, ZHU Tong-tong, ZHANG Xiu-guo, LI Zhuang*

271018,

can secret more than 370 RxLR effectors, and the characteristic of most effectors are unknown. In order to conduct deep functional studies on the RxLR effectors of, the specific primers forand RxLR115890, were designed using the DNA of thestrain SD33 as a template. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression level of RxLR115890 under the zoospores infection condition ofin different stages. The results showed that the expression level of RxLR115890 was significantly up-regulated at the early stage of infection, and the length of expression was decreased rapidly along with the infestation time, and slightly increased again at 12 hours. It was concluded that RxLR115890 has a crucial role in the early infection of. Furthermore, it established the foundation for the following research of RxLR115890.

; RxLR115890; real-time quantitative PCR; expression

S436.418.1+2

A

1000-2324(2018)03-0388-05

2017-11-12

2018-02-20

國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-25-03B)

張麗(1991-),女,在讀碩士研究生,研究方向:植物病原卵菌分子遺傳學(xué). E-mail:1300194196@qq.com

Author for correspondence. E-mail:liz552@126.com