尾礦土中解磷細菌的篩選及對鎘的耐受研究

(.四川省自然資源科學研究院,四川 成都 6004;.四川農業大學,四川 成都 630)

礦產資源是國民經濟的重要支柱,但礦產資源的開采會造成礦區土壤的嚴重破壞。據報道,我國采礦業形成的礦山、排土場、尾礦庫等導致約400萬hm2的土地受到破壞,并且以每年4萬hm2左右的速度增加[1]。近年來,盡管我國礦山治理取得了較大的進展,廢棄地復墾系數已達到12%,但與發達國家100%的復墾率相比,仍存在著很大的差距,我國的礦山廢棄地復墾任重道遠[2]。在礦區土壤復墾中，面臨較嚴重的問題是礦區土壤十分貧瘠。通過對礦區具有促進植物生長的細菌篩選,篩選出具有解磷、解鉀等作用的細菌,且從礦區土壤中分離出的土著細菌具有抗重金屬脅迫的能力。通過該類細菌對高濃度重金屬耐受程度的測定,可進一步篩選出既具有促生作用又能耐受礦區高含量重金屬的細菌菌株,為礦區污染土壤修復提供寶貴的微生物資源,也為增加土壤肥力的微生物菌種開發提供必要的條件。

攀枝花位于四川省西南部,是我國重要的釩鈦鋼鐵基地。攀枝花地區礦產資源豐富,已發現76種礦產,潛在儲量在300億t以上,其中釩鈦磁鐵礦儲量96.6億t,鈦儲量占世界鈦總量的35.2%，為世界之最[3]。經過幾十年的開采,攀枝花形成的廢礦區面積高達2724.93hm2,造成土地質量和土壤承載能力大大降低,土壤酸化，重金屬污染，有機質和氮、磷含量較低,持水能力差,土壤生態系統受到嚴重破壞[4]。當地政府積極采取措施治理工礦廢棄地,開始對廢棄礦地進行退建復耕或還林還草,取得了一定的成效,2012年攀枝花成為我國工礦廢棄地復墾利用試點城市[5]。總體看,攀枝花廢棄礦區環境污染和生態破壞的局面未得到根本改觀[6]。尾礦是礦石經選別出精礦后剩余的固體廢料,尾礦量大,侵占了大量土地資源,嚴重破壞了當地的生態環境[7]。尾礦中各種殘留成分對環境造成了嚴重破壞,部分篩選藥劑也有可能對生態環境造成不可逆的損害。如鐵礦、磷礦等尾礦中含有大量重金屬,隨著這些重金屬排放到土壤和河湖水體,將會嚴重破壞人類賴以生存的環境,同時重金屬會進入人們的食物鏈,對人體造成嚴重的影響[8,9]。因此,為了減小礦業開采對生態環境的破壞,應加強尾礦庫土地復墾和礦區土壤修復,這是礦業持續發展有待解決的主要問題之一[10]。

目前,攀枝花礦區土壤復墾面臨的難題是復墾區的土壤貧瘠問題。由于尾礦區土壤營養成分缺乏,很多復耕植物生長差,急需提高土壤肥力以促進復耕植物生長。磷元素是植物生長必需的三大主要元素之一,是生物體內核酸和磷脂的重要組分,也是生物膜、原生質和細胞核的組成成分之一[11]。我國大部分地區土壤中的含磷量平均僅為0.12%,土壤溶液中的濃度一般在0.005—1.0mg/kg,總磷含量雖然豐富但有效磷匱乏是磷元素的主要特征,可溶性磷含量較低不易被植物吸收利用,施入土壤的磷肥利用率僅為5%—25%[12]。土壤中磷元素含量較高,但大多是以難溶于水的復雜化合物,植物吸收這些大分子含磷化合物較困難。大分子含磷化合物在微生物尤其是在細菌的作用下,將不溶于水的含磷化合物分解為可溶性化合物,是解決土壤缺磷的主要途徑。微生物代謝產生的植酸酶、核酸酶和磷酸酶等可加速含磷有機化合物分解,極大地改善了植物的磷素營養狀況,可在不增加化學磷肥的狀況下提高土壤磷元素含量[12-15]。通過篩選開發具有溶磷效應的微生物菌劑,改善礦區尾礦復耕區的有效磷含量是提高尾礦復耕率的重要措施之一[16]。在實際應用中,特別是在尾礦修復中,尾礦中的重金屬含量和其他有害藥劑超標,很多具有促進解磷溶磷效果的菌劑很難在重金屬含量較高的尾礦庫土壤中生長,溶磷作用受到嚴重抑制。本研究以尾礦庫土壤為研究對象,從中篩選出兼具溶磷效果和抗重金屬脅迫的細菌菌種。由于該細菌對生長環境的自然選擇,本身具有很好的抗重金屬能力,可結合兩種功效,促進尾礦區復耕。

目前,對微生物參與難溶態磷素利用的研究多在芽孢桿菌,其次主要在真菌和放線菌等方面[17,18]。溶磷細菌主要包含以下類別:芽胞桿菌(Bacillus)、歐文氏菌(Erwinia)、假單胞桿菌(Pseudomonas)、土壤桿菌(Agrobacterium)、沙雷氏菌(Serratia)、黃桿菌(Flarobacterium)、腸細菌(Enterbacter)、微球菌(Micricoccus)、固氮菌(Azotobacter)、根瘤菌(Rhizobium)、沙門氏菌(Salmonella)、色桿菌(Chromobacterium)、產堿菌(Alcaligenes)、節細菌(Arthrobacter)、硫桿菌(Thiobacillus)、埃希氏菌(Escherichia)[19];解磷真菌在數量上遠低于解磷細菌,主要分布在曲霉(Spergillus)、青霉(Penicillium)、鐮刀菌(Fusarium)、小絲核菌(Sclerotium)等屬種。在解磷微生物種中,不同種類的微生物不但解磷能力差異大,且解磷機理也不盡相同[20]。多數研究認為,解磷菌的解磷作用是微生物的次生代謝產物導致含磷化合物的可溶性改變,微生物產生的有機酸對含磷化合物的可溶性提高起到了關鍵作用,微生物改變了土壤中的pH,最終導致磷酸鹽的可溶性變化[18,21,22]。

本研究從攀枝花釩鈦磁鐵尾礦土中分離篩選到具有較好溶磷效果的細菌菌株,運用分子方法鑒定出細菌的種屬,并在室內條件下初步研究了溶磷能力和菌株生長量[20]。然后在重金屬脅迫下測定解磷菌株,分析對重金屬的耐受性和在重金屬脅迫下解磷菌的溶磷效果,得出重金屬鎘對解磷菌株的抑制濃度和致死濃度。最后篩選和構建高效解磷菌株,為利用解磷菌提高尾礦磷素利用效率提供理論依據,也為尾礦土壤的生物修復和尾礦堆積物的復墾提供可利用的解磷菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

解磷細菌:本研究的土壤細菌主要來源于攀枝花朱家包包礦區的廢礦土壤。

培養基與試劑:①(PKO)無機磷固體培養基。葡萄糖10g、磷酸鈣5g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.2g、MgSO40.03g、MnSO40.03g、FeSO40.003g、瓊脂18g、KCl 0.2g、去離子水1L、pH6.8—7.0。②PKO液體培養基。葡萄糖10g、磷酸鈣5g、(NH4)2SO40.5g、NaCl0.2g、MgSO40.03g、MnSO40.03g、FeSO40.003g、KCl 0.2g、去離子水1L、pH7.2[23]。③TY培養基。葡萄糖10.0g、NaC l5.0g、蛋白胨2.0g、酵母膏5.0g、pH7.2。④鉬銻抗試劑。稱取酒石酸銻鉀(KSbOC4H4O6)0.9g,緩慢溶于100mL水中,制成5%的溶液。稱取鉬酸銨20g溶于雙蒸水450mL,緩慢加入208.3mL(質量分數98.3%)濃硫酸,同時用玻棒攪動散熱,再將0.5%的酒石酸銻鉀100mL加入到鉬酸銨液中,定容至1L,充分搖勻,貯于棕色瓶中避光保存[24]。

1.2 方法

礦土樣采集:將攀枝花朱家包包廢礦區作為具體測試點,隨機選擇三個采樣區域(廢礦區Ⅰ、廢礦區Ⅱ、廢礦區Ⅲ),每個區域間距根據廢礦區具體情況而定(間距相同),包括廢礦新區、老區和尾礦區,做好登記;每個采礦區域選取5點(梅花型布點),兩點之間至少相距5m(圖1),采集0—30cm土層樣品,混合后四分法分取并裝入無菌聚乙烯塑料袋中,運回學校實驗室做下一步實驗。

圖1 廢礦區采集樣點分布

尾礦土壤細菌的分離與純化:尾礦土壤細菌的分離主要采用稀釋平板涂布法。實驗前準備裝有9mL無菌水的試管24支、滅菌移液管7支、牛肉膏蛋白胨培養基平板12個、無菌培養皿9個、尾礦土壤土樣5.0g;將土樣加入5mL無菌水的三角瓶,搖30min混均勻,再用移液槍吸取1mL加入9mL無菌水的試管,逐一稀釋,細菌分別稀釋到10-6、10-5、10-4;另吸取150μL不同濃度的稀釋液用涂布棒在牛肉膏培養基上涂布均勻,每個做3個重復,置于28℃的培養箱中培養2天,挑選出不同形態的單菌落進行劃線純化,做革蘭氏染色后鏡檢,菌株形態單一的視為獲得純化菌株,然后在牛肉膏斜面(4℃)和甘油管(-80℃)中保種。

解磷細菌定性分析:采用PKO平板培養法,每個平板采用點接法,每株菌株接3個平板,28℃培養7天。同時，觀察并測量菌落直徑大小以及其周圍透明圈的大小,根據透明圈評判該菌株是否具有溶磷作用。

解磷細菌定量分析:將30mL液體PKO置入50mL的三角瓶中,121℃滅菌30 min,按1%接種量在30mL液體PKO培養基中接入各供試菌株種子液,每株菌3個重復,并在同樣的PKO液體培養基中接入等量無菌水作為對照。在28℃、150r/min振蕩培養7天后,取出培養液8000 r/min離心10min,稀釋上清液后用鉬銻抗比色法測定培養液中的有效磷。

解磷菌株的產量確定分析:配制1L的PKO液體培養基,每支試管分裝5mL,滅菌后冷卻至室溫,按照1%的接種量接種,每株菌株3個重復。對照CK為相同的PKO液體培養基中接種入等量無菌水。接種完成后置入溫度28℃、轉速150r/min恒溫搖床中培養,分別培養1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天,再分別在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天取出培養液,在轉速8000r/min離心機中離心5min,取上清液,用鉬銻抗比色法在波長660nm下比色,測定培養液的磷含量,最后確定解磷細菌解磷產量最高的一天,并篩選出磷含量最高的菌株進行下一步研究。

基因組DNA的提取:將篩選出解磷效果較好的菌株進行DNA提取,采用GUTC法(異硫氰酸胍),操作步驟見圖2。

圖2 GUTC法提取細菌總DNA流程

解磷菌株16S rRNA擴增與測序:以總DNA為模板,選用引物27F和1492R擴增16S rRNA[25],引物序列為:

圖3擴增程序

反應體系(25μL):2×PCR Mix 12.5μL;27F(10pmol)0.15μL;1492R(10pmol)0.15μL;模板DNA(50ng/ml)1μL;雙蒸水補足至25μL,石蠟油1滴覆蓋。擴增程序見圖3。

16S rRNA擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴增片段長度為1.5Kb,檢測后送上海生工基因公司測序。然后,將16S rRNA序列在GeneBank中進行Blast分析以確定其同源性，并將16S rRNA序列與標準菌株一起構建系統發育樹以分析尾礦土壤中解磷菌株的多樣性。

解磷細菌對重金屬鎘的耐受性分析:將濃度為5×10-5mol/L的Cd2+按照一定的含量梯度加入優勢菌株的TY溶液中,每株菌株3個重復。以接種到不含重金屬TY液體培養基作為CK。在28℃、150r/min振蕩培養1天后取出,取一定量的菌液用分光光度計(波長660nm)測定,進行OD值與空白對照比較,確定重金屬鎘抑制濃度和致死濃度。

重金屬鎘對解磷細菌的影響分析:每支試管裝入5mLPKO液體培養基,121℃滅菌30min,冷卻至室溫,在無菌工作臺上進行接種,分別接入濃度為5×10-5mol/L的Cd2+,接入量依次為0、2.5μL、5.0μL、7.5μL、10μL、12.5μL、15μL、17.5μL、20μL、22.5μL、25μL,將篩選出優勢細菌分別接入試管內;按1%接種量置入5mLTY液體培養基中,再置入各供試菌株種子液,每株菌3個重復,以同樣在TY液體培養基中接入等量無菌水作為CK。接種完成后放入28℃、150 r/min的恒溫搖床振蕩培養3天后,取培養液在轉速8000r/min離心機里離心5min,然后取上清液用鉬銻抗比色法在分光光度計(波長660nm)下比色,測定磷含量。

2 結果與分析

2.1 尾礦土壤細菌分離結果

本實驗采用稀釋平板涂布法從攀枝花朱家包包廢礦土壤中分離出純化細菌,在挑選單菌落時主要根據菌落形態的大小、顏色、形狀等挑選不同菌落特征的菌株136個。在純化過程中利用顯微鏡觀察菌體形態,其中大部分細菌為革蘭氏陽性細菌,菌體形態為桿狀。

表1 解磷細菌定性篩選結果

2.2 解磷細菌的篩選結果

解磷細菌的初篩結果:對136株尾礦土壤細菌菌株進行初篩后得到4株菌株具有解磷效果,其溶磷圈直徑見表1。從表1可見,分別為WDGJ-20、WDN-5、KX-2、BDGJ-15菌株。

解磷細菌定量時間測試分析:將篩選出的4株優勢解磷菌株進行解磷定量測試,通過7個不同時間點取樣測試,評估得到不同時間點的解磷效果:4株優勢細菌在第5天時的解磷效果最明顯,其中WDN-5比其他3株菌的溶磷量高(圖4)。

圖4 不同培養時間下解磷菌的溶磷量

2.3 解磷細菌分子鑒定

我們將篩選出的4株解磷菌株進行16S rRNA的PCR擴增,產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴增條帶約1400bp,PCR產物送交測序公司進行測序。對4株解磷菌株的16S rRNA基因序列在GenBank數據庫進行BLAST比對,分析溶磷效果較好的4株解磷菌株的同源性與種屬均屬于Bacillus屬(表2)。其中,WDN-5為效果最好的1株解磷菌,將WDN-5 16S rRNA基因序列構建系統發育樹(圖5)。結果顯示，與標準菌株Bacillus subtillis GU086413在同一個分支上,且相似度為99%,說明屬于Bacillus subtillis。

表2 解磷菌株16sRNA基因測序及同源性分析

2.4 重金屬鎘脅迫下解磷細菌解磷能力測定

解磷細菌對重金屬鎘的耐受性分析:通過在解磷菌優勢菌株WDN-5培養液中加入不同含量的重金屬鎘,以不加重金屬鎘的優勢菌株WDN-5培養液為對照CK,在28℃、150 r/min搖床振蕩培養1d后取出,取約2mL的培養液經過分光光度計測定,測定出空白對照CK的OD值為0.307。從圖6可知,致死濃度為300mg/L,所以選取0—300 mg/L作為培養濃度進行重金屬鎘脅迫試驗。

重金屬鎘脅迫下的解磷菌解磷能力測定:根據解磷細菌對鎘的耐受性分析,耐受性選取0—300mg/L作為培養含量進行重金屬鎘脅迫試驗。通過設計鎘的不同含量梯度重金屬脅迫實驗,用鉬銻抗比色法測定磷含量。WDN-5菌株在重金屬鎘0—300 mg/L濃度之間隨著濃度逐漸增加對其解磷能力逐漸減少(圖7)。

圖5 WDN-5的16S rRNA系統發育樹

圖6 鎘對WDN-5抑制濃度和致死濃度

圖7 鎘脅迫下WDN-5的解磷作用

3 結論與討論

本研究將具有解磷作用的菌株接種到含有難溶性磷酸鹽的固體培養基上,在適宜的溫度條件下培養,通過測定菌落周圍產生的透明圈的直徑大小來判定該微生物溶磷能力。

本研究通過從尾礦土中分離篩選微生物,經過在PKO平板上28℃培養7天后,初步篩選出的4株細菌透明圈直徑均超過了2cm,這些透明圈表明該細菌具有很好的解磷溶磷作用。溶磷暈圈直徑的大小可定性地反映細菌的溶磷磷能力,而要定量評價菌株的解磷能力,則需要通過溶磷時間分析實驗確定。通過溶磷定量時間分析,本研究篩選出溶磷效果最好的WDN-5菌株在培養后第5天的效磷含量為77.14μg/mL,在上清液中的溶磷量達到71.92μg/mL。本研究分離得到的WDN-5為芽孢桿菌,培養第5天后的溶磷作用達到77.14μg/mL,具有較好的溶磷效果。此外,本研究是從礦土分離得到細菌,其生活的環境決定了自身具有很好的抗逆性和抗重金屬脅迫性。通過后續的研究表明,WDN-5在較高重金屬鎘的脅迫下具有解磷效應,可更好地應用到重金屬超標的尾礦庫中和較高重金屬含量的農田中,應用前景廣闊。

高濃度的重金屬是礦區土壤生物修復過程中最重要的限制性因素,Cu、Cd、Pb、Cr對芽孢桿菌有明顯的抑制作用,其中以大芽孢桿菌更為敏感。因此,需要篩選一些具有較強的能夠的優勢菌株作為菌劑使用,為尾礦土壤的生物修復和尾礦堆積庫的復墾提供可利用的解磷菌株資源。本研究從釩鈦磁鐵礦區表層土壤中所篩選到的解磷細菌WDN-5,除了具有很強的解磷能力外,對鎘的耐受性也很好,雖然它不能直接富集重金屬,但可作為尾礦庫的植物修復提供必要的條件。

通過測定在含有重金屬鎘的培養基中解磷細菌WDN-5解磷能力的變化情況,表明該細菌的溶磷作用會隨著重金屬濃度的增高而降低,WND-5對鎘的致死濃度為300 mg/L;在50—300 mg/L的鎘脅迫下,隨著鎘濃度的增加,WDN-5的溶磷量逐漸降低。本研究開發的細菌可用于含有重金屬鎘的尾礦庫中,通過溶磷細菌的溶磷作用,增加尾礦庫土壤的養分含量,為尾礦庫的植物修復提供了土壤條件。本研究主要對耐受重金屬鎘的解磷細菌開展菌株篩選和耐受性研究,對細菌耐受重金屬的機理未進行深入研究,這是下一步的研究工作,以期為重金屬污染的土壤開展植物修復提供更多的微生物菌群。

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