基于水汽凝結原理的汽凝儀的開發與應用研究

謝麗萍，鐘俊杰，張旭哲，李冠孚

東北大學 中荷生物醫學與信息工程學院，遼寧 沈陽 110819

引言

基因檢測已成為疾病早期診斷、有害細菌或病毒檢測、以及法醫學應用的關鍵技術[1-2]。目前，已經開發出多種用于篩選基因突變的方法，包括等位基因雜交法、核苷酸摻入的引物延伸法、質譜法、核酸測序以及實時定量聚合酶鏈反應檢測等。但是，大多數的方法需要高成本的探針標記以及昂貴的檢測儀器（如激光共焦生物芯片掃描儀，CCD生物芯片掃描儀）[3-4]。此外，熒光探針容易漂白，增加了操作的復雜性。

露珠的形成是自然界中一種典型的水汽凝結現象。平時不容易看出的蜘蛛網，掛上露珠后晶瑩剔透，在陽光下異常顯眼。凝結的露水通過反射光線，使得蜘蛛網相比背景更亮，產生了更強的可視信號。水汽凝結產生的圖案提供了一種穩定的、無標記以及無需供能的“綠色”成像方法，常用于玻璃清潔度及均一性檢查[5]。隨著人們對水汽凝結的興趣的增長，很多的研究集中于形成水汽凝結的實驗方法研究及理論探討。水汽凝結方法已用于制作各種多孔材料[6]，甚至設計可調控的汽凝納米顯微鏡[7]。很多研究采用水汽凝結方法識別不同應用目的的自組裝分子層排布[8-9]。水汽凝結是一種低成本、無損傷、無需供能的“綠色”方法，可以在短時間內（1 min）區分表面屬性，并且具有高度可重復性[10]。

為了降低檢測成本，Xie等[11]首次報道了利用水汽凝結信號檢測p53基因的249編碼區的基因突變。分析物引起的DNA擴增網絡改變了檢測點的濕度，水汽凝結信號讀取方式將芯片的濕度變化轉化為可視信號，只需哈一口氣，即可實現基因突變的肉眼識別。哈氣形成水汽凝結的方法雖然操作簡便，但受外界環境的影響較大，在一些惡劣條件下，如高溫（＞40℃），空氣濕度低（＜30%）等條件下，哈氣不易形成凝結，影響信息的讀取。

本項目搭建了便攜式汽凝儀，提供了基于汽凝法的基因芯片檢測信號輸出環境，將超聲霧化的原理結合到汽凝儀中，提供了穩定的濕度條件，并可實時采集圖像，對采集的圖像進行分析，自動定位芯片捕獲探針的陣列點，實現了基因點突變信號的讀取。

1 系統硬件

1.1 結構設計

汽凝儀由控制分析模塊、顯示模塊、圖像采集模塊、超聲霧化模塊組成，見圖1。本文采用Solidworks軟件設計了便攜式汽凝儀的外觀以及內部結構（圖1a）。完成三維結構設計后，使用光敏樹脂為原材料，利用3D打印機打印出儀器的整體結構。汽凝儀的外觀，見圖1b。特別強調的是，為防止超聲霧化模塊對其他模塊的影響，采用了分隔設計，圖像采集模塊在超聲霧化模塊的正上方，與汽凝儀其他模塊分開，通過隔板隔離（圖1c），確保了超聲霧化模塊不會將水霧噴灑到微型控制器上而導致系統發生故障。超聲霧化模塊的上面設置載物臺（圖2a），放置待測芯片。超聲霧化模塊的儲水箱的設計利用了蓄水的原理。從載物臺的右側注水口注入純凈水，左端插入霧化片（圖2b），并采用密封膠密封，形成水霧的供給源。設置5個噴口，采用彎形噴嘴設計，以增大噴霧面積及分散噴霧強度。霧化片接觸水面產生水霧，通過出霧口噴出，增加了芯片表面空氣的濕度，為基于汽凝法的基因芯片的檢測提供了水汽凝結的檢測環境。

圖1 汽凝儀結構示意圖

圖2 汽凝儀的超聲霧化模塊的結構示意圖

1.2 硬件功能

汽凝儀的硬件部分由pcDuino微型控制器、超聲霧化模塊、圖像采集模塊和顯示模塊等構成（如圖1c）。pcDuino3是搭載AllWinner 雙核A20芯片的微型電腦[12-13]，有最高達1 GB的RAM，機身自帶有4 GB內存，可通過microSD存儲卡擴充至32 GB，能根據項目的需求自行選擇搭載Ubuntu、Android等多種操作系統。該系統完全滿足了汽凝儀對硬件的功能需求。Ubuntu系統能較為容易的適配攝像模塊和顯示模塊的相關驅動，方便后續的工作。更為重要的是，相比于樹莓派等其他微信電腦，pcDuino自身搭載了Arduino開發環境，完全兼容Arduino的開發接口，便于功能模塊的擴展，如加濕模塊就可以使用Arduino串口方式供電或者操控，而不僅僅是依賴于pcDuino本身自帶的USB接口供電。pcDuino構成了汽凝儀的核心控制模塊。

汽凝儀的超聲霧化模塊的功能是提供一個穩定的水汽環境。本文應用家用加濕器工作方式，通過超聲產生水霧環境。本文設計的超聲波電路利用超聲霧化片產生霧化的水汽，通過特定的通道將霧化的水汽集中引向生物芯片上方，增加了空氣濕度，使水汽可以凝結在芯片表面，以便觀察實驗結果。超聲霧化模塊由陶瓷霧化片及其驅動電路以及儲水箱構成。霧化片放置在儲水箱中，采用密封膠密封好后，注入水，霧化片接觸到水，便可以產生水霧。霧化片的驅動電路實現出霧量的控制。其驅動電路包括穩壓部分、升壓部分以及單片機部分。通過升壓電路和5 V的穩壓電路維持單片機以及霧化片正常工作電壓，然后通過預設程序讓單片機輸出一定頻率的方波，通過陶瓷霧化片的高頻振蕩使水霧化，出霧量穩定，操作方便。

圖像采集模塊采用500萬像素的微距攝像頭，可以較為清晰的采集到芯片上的照片。因為鏡頭與芯片距離固定，焦距不會變化，采用手動對焦方便快捷，故在裝置安裝好以后需要調好焦距再進行照片的采集。顯示模塊采用IPS（平面轉換）電阻觸摸屏顯示采集的芯片圖像。

2 DNA芯片圖像處理算法

為了實現基因芯片的陣列點的自動識別分析，本文開發了基因芯片圖像處理算法。首先通過圖像預處理方式進行除噪，然后將圖像中的反應點都分割出來，對分割后的圖像進行判斷。如果沒有不需要的噪點，便可以將檢測點的位置信息保存下來，將這些位置信息和預先給定的芯片反應點位置信息進行比對，識別哪些位點發生了特異性反應從而得出該芯片的實際反應結果。具體操作如下：第一步是將采集到的原始圖像轉化為8位的灰度圖，用圓盤結構體對灰度圖像進行一次腐蝕操作，接著對其進行形態學開重建，再對其進行一次膨脹操作，最后進行形態學閉重建。經過上述步驟，可得到大部分小的噪點被消除的灰度圖像。盡可能消去噪點后，需要將反應點從預處理后的灰度圖中提取出來。擴展極小變換是一種相對精確的求區域極小的算法，相比于直接求區域極小變換，擴展極小變換可以抑制那些與周圍區域相比對比度較小（小于閾值）的極小點，本文記錄下區域邊界的灰度值，然后給整個區域加上一個閾值，對于加閾值后灰度值大于等于原邊界灰度值的，將其置成原邊界灰度，以有效改善區域極小變換過分割的情況。相比一般的分水嶺算法，擴展極小變換能更好地將圖像中的亮點區分開，不留下過多的噪點。在得到黑白二值化的圖像后，本文會先根據留下的白點大小進行一次去噪，將明顯的噪點去除。同時，因為芯片上的陣列點是呈垂直對應的關系，根據這個特征，可以先對一定數量的圖像進行統計，判定出反應點之間的距離D。由于芯片距離攝像頭的位置是不會改變的，故圖像中反應點之間距離D是一個定值。在經過基于面積中值的去噪后，可通過對比每個點圓心為中心的x、y軸方向上距離為D的是否存在其他反應點作為判斷的依據。若其在x、y軸4個垂直方向的一定距離內不存在其他對應關系的點，那么就判定這個點是噪點，再進行一次去噪。經過兩次去噪，能基本全部除去原圖像上的噪點，只留下芯片上反應的檢測點。標記識別出的基因點突變反應點，從而完成基因點突變自動識別分析，此算法能精確的區分反應點，算法識別準確度高。

3 驗證實驗

由博奧生物芯片有限公司制備突變捕獲探針（5 μm）陣列，各個檢測點之間距離200 μm。將100 nM的待檢測的基因突變片段（表1中野生序列、突變序列）、5 μm報告探針和0.8 U/μL Taq DNA連接酶組成的混合液 5 μL，加入到芯片表面，60℃下反應1 h。之后浸泡在0.01 M NaOH溶液中5 min。去除反應液，向芯片表面加入10 μM環模板、10 μM鏈條與0.2 μL的T4 DNA 連接酶混合液，室溫反應2 h。取5 U/μL Phi29 DNA聚合酶、緩沖液以及880 μM dNTP）5 μL加入到芯片表面，30℃反應4 h。采用本文汽凝儀觀察記錄檢測結果。

4 結果與討論

為了驗證本文汽凝儀的功能，進行了人體抑癌基因p53的220編碼區的基因突變檢測實驗。p53是目前世界上研究較為廣泛的抑癌基因。它是生物體中一種抑制正常細胞轉變為癌細胞的基因，在控制細胞生長，增殖及凋亡方面充當著重要作用。p53抑癌基因突變可能會引發腫瘤產生。檢測抑癌基因p53的基因點突變的序列設計，見表1。設計原則遵循：捕獲探針與報告探針無互補雜交，即捕獲探針存在時，不能與報告探針形成非特異性連接，保證只有目標基因存在時才能產生信號的輸出。檢測原理，見圖3。

首先是芯片的制備，通過點樣儀將捕獲探針通過5’端的氨基與環氧硅烷修飾的SiO2修飾的硅片連接，每個基因點間距為200 μm，每個基因點直徑約為50 μm。待分析物與報告探針一起加入到芯片上，當待分析物與捕獲探針、報告探針能無差錯的堿基互補配對，則將報告探針與捕獲探針連接起來。若當待分析物與捕獲探針、報告探針有一個堿基的錯配，報告探針無法連接捕獲探針。之后，向芯片上加入環（借助鏈條DNA使環形模板連接成環狀）。利用滾環擴增技術擴增出大量的DNA[14-15]。由于DNA網絡具有親水性，特異性識別的區域的濕潤度發生改變，無目標檢測基因的檢測點，由于無法連接報告探針，不能進行RCA擴增，檢測點濕潤度不發生改變。汽凝儀的超聲霧化片產生的水霧遇到芯片表面，在特異性識別區域（即濕潤度改變區域）形成一層水膜[16]，通過光的反射現象，可以將DNA的一個堿基的基因突變事件轉變為可視光線，形成可視的光斑。光斑與DNA的堿基突變事件正相關，即若待檢測物中含有目標的DNA序列，芯片檢測點處擴增出大量DNA，改變了此檢測位點的親水性，水汽凝結在表面形成的水膜對該位點起到了放大作用，通過微距鏡頭采集由顯示模塊顯示采集結果。

表1 單鏈核苷酸序列

本文采用基因芯片用以檢測抑癌基因p53的220編碼區的基因突變（TAT ＞ -TGT）。固定了野生基因TAT、突變基因TGT的捕獲探針的芯片，通過基因特異性識別來檢測相應的野生基因TAT、突變基因TGT。最后通過汽凝儀進行信號采集和輸出。水汽凝結后的芯片檢測結果輸出，見圖4a，前兩行為特異性識別野生基因TAT的結果，后兩行為特異性識別突變基因TGT的結果。通過基因芯片圖像處理算法，可實現自動識別特異性檢測區域，并準確的圈出特異性信號輸出區域（圖4b）。為了進一步突出顯示特異性識別區域，以黑白二值化突出顯示檢測結果（圖4c）。與芯片基底固定相應探針的位置對比，可以確切得出目標基因的出現，即使有一個基因點突變，該方法也可以特異性識別出來。汽凝儀為基于汽凝法檢測基因突變提供了濕度環境，并可以采集圖片，實現圖片基因突變檢測點的自動識別。相比于基于熒光的芯片檢測儀器，大大降低了成本[17-18]。

圖 4 基于汽凝法的基因芯片檢測的照片（標尺為400 μm）

5 結論

本文開發了一種新型的基于水汽凝結原理的汽凝儀，成本低于500元，結合RCA擴增的基因點突變識別技術，可實現基因點突變的汽凝法檢測。該系統集成了控制模塊、顯示模塊、超聲霧化模塊、數據采集模塊，并通過3D打印技術，構建了汽凝儀的外觀結構。此外，開發了用于自動識別基因點突變的檢測算法。本文采用此設備檢測了p53的220編碼區的TAT到TGT突變識別驗證實驗表明了本文汽凝儀的數據采集和顯示功能并成功用于芯片基因點突變檢測。

[參考文獻]

[1] Zhang H,Liu X,Liu M,et al.Gene Detection: An Essential Process to Precision Medicine[J].Bios Bioel,2017,99:625.

[2] Gao Y,Deng L,Yan Q,et al.Single molecule targeted sequencing for cancer gene mutation detection[J].Sci Rep,2016,6(1):26110.

[3] Tang X,Morris SL,Langone JJ,et al.Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance[J].J Microbiol Methods,2005,63(3):318-330.

[4] Zhang ZW,Zhou YM,Zhang Y,et al.Sensitive detection of SARS coronavirus RNA by a novel asymmetric multiplex nested RTPCR amplification coupled with oligonucleotide microarray hybridization[J].Methods Mol Med,2005,114(3):59-78.

[5] Aitkek J.Breath figures[J].Nature,1911,86(2172):516-517.

[6] Bai H,Du C,Zhang A,et al.Breath figure arrays: unconventional fabrications, functionalizations, and applications[J].Angew Chem,2013,52(47):1240-1255.

[7] Mcleod E,Nguyen C,Huang P,et al.Tunable vapor-condensed nanolenses[J].Acs Nano,2014,8(7):7340.

[8] Erath J,Cui J,Schmid J,et al.Phototunable Surface Interactions[J].Lang Acs J Surf Coll,2013,29(39):12138-12144.

[9] López GP,Biebuyck HA,Frisbie CD,et al.Imaging of features on surfaces by condensation figures[J].Science,1993,260(5108):647-649.

[10] Hofer RM,Textor A,Spencer ND.Imaging of surface heterogeneity by the microdroplet condensation technique[J].Langmuir,2001,17(13):4123-4125.

[11] Xie L,Wang T,Huang T,et al.Dew inspired breathing-based detection of genetic point mutation visualized by naked eye[J].Sci Rep,2014,4:6300.

[12] PCDuino User Guide (n.d.)[EB/OL].[2013-03-08].http://www.doc88.com/p-9883114996220.html.

[13] Gómez A,Cui?as D,Catalá P,et al.Use of single board computers as smart sensors in the manufacturing industry[J].Proc Engin,2015,132:153-159.

[14] Schweitzer B,Roberts S,Grimwade BW,et al.Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification[J].Nat Biotech,2002,20(4):359-365.

[15] Xie L,Cheng H,Qi H,et al.Nanostructural morphology masterregulated the cell capture efficiency of multivalent aptamers[J].Rsc Advances,2015,5(50):39791-39798.

[16] Muller PA,Vousden KH.p53 mutations in cancer[J].Nat Cell Biol,2013,15(1):2-8.

[17] Duffy MJ,Synnott NC,Crown J.Mutant p53 as a target for cancer treatment.[J].Eur J Cancer,2017,83:258-265.

[18] Wen L,Tian Y,Jiang L.Bioinspired super-wettability from fundamental research to practical applications[J].Angew Chem,2015,54(11):3387.