新型高氮無鎳不銹鋼與L605合金及316L不銹鋼生物相容性對比研究

劉美霞，趙靜，王青川，張炳春，楊柯

中國科學院 金屬研究所，遼寧 沈陽 110016

引言

生物醫用金屬材料具有高強度、良好的韌性、良好的抗疲勞性能和優異的加工成型性，并且具有優異的抗腐蝕性能和良好的生物相容性，被廣泛用于制造各類臨床植入體[1]。316L不銹鋼（316LSS）和鈷鉻合金（L605）是臨床中應用最廣泛的心血管支架材料，但其中都含有9wt.%以上的鎳（Ni）元素。大量臨床實驗證明，Ni是一種潛在的致敏因子，鎳離子在生物體內富集可能會誘發毒性效應，導致細胞破壞和炎癥反應，對生物體有致畸、致癌的潛在危害[2-5]。因此，降低材料中Ni的含量是提高材料生物相容性的重要手段。

隨著對材料中Ni的含量要求越來越嚴格，早在20世紀90年代國內外就已經開展了高氮無鎳不銹鋼的研究和開發工作。1996年Menzel等[6]對高氮無鎳奧氏體鋼在醫療領域中應用的可行性進行了分析，對Fe-18Cr-18Mn-2Mo-1N高氮無鎳不銹鋼的組織和性能進行了全面研究。同時，通過降低鋼中的Cr和Mn含量，適當提高Mo含量，開發出Fe-15Cr-(10-15)Mn-4Mo-0.9N高氮無鎳醫用不銹鋼[7]。近年來，美國、日本、加拿大等國家對高氮無鎳不銹鋼在骨科及心血管方面的應用也開展了相關研究[8-12]。以上研究均表明，較傳統不銹鋼316L SS，高氮無鎳不銹鋼具有更加優異的力學性能、耐蝕性能及生物相容性。在國內，中國科學院金屬研究所楊柯研究員領導的生物材料課題組首次研發出一種新型高氮無鎳不銹鋼（High Nitrogen Nickel-Free Stainless Steel，HNNFS）心血管支架材料，目前已經取得突破性進展[13]。本文開展HNNFS與L605、316LSS的生物相容性對比研究，通過溶血及細胞增殖等實驗，對3種材料的血液相容性以及對血管平滑肌細胞的增殖作用進行評價，為HNNFS在心血管支架領域的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料制備

本實驗將HNNFS作為實驗材料，將L605和316LSS作為對比材料。將樣品加工成直徑為10 mm，厚度為1 mm的薄片，經水磨砂紙逐級打磨拋光后，酒精超聲清洗并吹干。實驗前，將樣品在121℃高溫下滅菌20 min，烘干后備用。

1.2 溶血率實驗

本實驗嚴格依照GB/T 16886.4的標準執行[14]。實驗用血為沈陽血液中心提供的新鮮人血，并添加抗凝劑。每種樣品設置5個平行樣，分別置于離心管中，按照樣品面積與溶液體積為3 cm2/mL的比例分別加入1 mL的0.9%NaCl溶液，陰性對照為同體積的0.9% NaCl溶液，陽性對照為同體積的蒸餾水。將所有樣品放入37℃恒溫培養箱中培養30 min后，按照0.2 mL/10 mL加入稀釋人血（人血與0.9% NaCl以4：5比例稀釋）。在恒溫培養箱中繼續培養

60 min后，經3000 r/min速率離心5 min后取上清液，并加入至96孔板中，用酶標儀在545 nm波長處測量光密度（OD）值。溶血率計算公式如下：

式中：OD實驗組——實驗組樣品的吸光度值；OD陰性組——陰性對照的吸光度值；OD陽性組——陽性對照的吸光度值。

1.3 細胞培養

實驗中采用人臍動脈平滑肌細胞（HUASMC），對材料與細胞的相互作用展開研究。HUASMC購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。將細胞培養于含10%胎牛血清（BI，美國）和0.5%青鏈霉素（Gibico，美國）的1640培養基（Hyclone，中國）中，并置于含5%CO2，37℃/95%濕度條件的培養箱中，待細胞生長覆蓋培養皿的80%時傳代。加入含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞并收集細胞至5 mL離心管中，1000 rpm離心5 min后，棄上清液，加入一定量培養基備用。

1.3.1 材料對HUASMC增殖率的影響

將材料置于48孔板中，取濃度為1×104/mL的細胞懸液100 μL接種于樣品表面，培養8 h待細胞貼壁后，加入1640培養基，并培養1、3和5 d，同時設置陰性對照（完全培養基）。到了既定時間點，加入含EDTA的0.25%胰蛋白酶將樣品表面細胞消化下來，1000 rpm離心5 min后，棄凈上清液，加入100 μL 1640培養基重懸細胞后加入至96孔板中，加入10 μL MTS（Signalway，美國），在培養箱中繼續孵育4 h后，在酶標儀490 nm波長下測量OD值，并計算細胞相對增殖率（Relative Growth Rate，RGR），計算公式為：

式中：OD實驗組是實驗組吸光度值；OD陰性組是陰性對照組吸光度值。

1.3.2 材料對HUASMC黏附的影響

將實驗材料置于48孔板中，取濃度為1×104/mL的細胞懸液接種于材料表面，在CO2培養箱中培養1、3和5 d。達到既定時間后，取出樣品，經PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS再次浸洗3次后，使用DAPI（碧云天，中國）對細胞核進行染色，并在熒光顯微鏡（BK-6000，中國）下拍照。

1.4 統計學分析

采用SPSS 20.0統計學軟件進行統計學分析。每種材料測試3個以上樣品，結果用平均值±標準差表示。采用ANOVA方法進行整體性差異評價，方差齊性用LSD法進行組間比較；方差不齊用Dunnett’s T3法進行組間比較，P＜0.05為具有顯著統計學差異，P＞0.05為無顯著統計學差異。

2 結果

2.1 溶血率

3種材料的溶血率（圖1）均小于5%。根據國標可知，若材料的溶血率＜5%，則說明材料符合醫用材料的溶血試驗要求，若溶血率≥5%，則說明材料有溶血作用。由此可見，3種材料均符合醫用材料的溶血試驗要求，且HNNFS的溶血率明顯低于316L SS，與L605無統計學差異。

圖1 HNNFS與L605、316LSS的溶血率

2.2 材料對HUASMC的影響

2.2.1 細胞相對增殖率

HUASMC分別在HNNFS、L605及316LSS表面上共培養1、3、5 d后，細胞的相對增殖率結果，見圖2。由圖可知，培養1 d時，3種材料表面細胞增殖率相近；當培養3 d后，HNNFS表面細胞相對增殖率明顯低于L605和316LSS，體現出了優異的抑制平滑肌細胞增殖的能力。

2.2.2 細胞黏附

HUASMC在3種材料表面培養1、3、5 d后的黏附情況，見圖3。隨著培養時間的延長，HUASMC在L605及316LSS表面數量增加，表明細胞不斷在材料表面增殖；而HNNFS表面黏附的細胞數量明顯減少，展示了其對HUASMC增殖具有明顯的抑制作用。

采用Image J軟件，對每個實驗樣品隨機選擇5個視野計數，并進行統計學分析，發現HNNFS與L605和316L SS表面粘附的細胞數量與細胞增值率結果趨于一致，結果見圖4。

圖2 HNNFS與L605、316LSS對HUASMC增殖率的影響

圖3 HUASMC在HNNFS與L605、316LSS表面的粘附情況

圖4 HUASMC在HNNFS與L605、316LSS表面的粘附數量

3 討論

溶血試驗是評價生物醫用材料血液相容性最基本的方法。當生物材料植入人體與血液接觸后，材料表面與紅細胞接觸后造成細胞膜的損害，血紅蛋白釋放到血漿中，發生溶血[15-16]。由于高氮無鎳不銹鋼是一種惰性金屬材料，因此在體液環境中溶出的毒性金屬離子量微少，對紅細胞的破壞微弱，不易發生溶血。此外，與L605和316L不銹鋼相比，由于屏蔽了有害鎳離子對溶血的促進作用，因此高氮無鎳不銹鋼顯示出更優異的抗溶血性能[17]。

臨床研究表明[18-20]，支架在植入人體后，對血管壁造成的損傷、炎癥反應會導致血管平滑肌細胞的過度增殖以及血栓形成，從而引起血管支架內再狹窄。Koster等[21]研究了鎳、鉻和鉬等金屬離子釋放引起的過敏反應與支架內再狹窄之間的關系，認為金屬離子（特別是Ni）引起的接觸過敏加重了炎癥反應，刺激了支架周圍新生組織的增生，從而增加了支架內再狹窄的可能性。另有研究認為鎳是慢性難治性支架內再狹窄的主要原因之一[22-24]。因此，研究支架材料對平滑肌細胞增殖的影響起著至關重要的作用。有研究證明[25]，HNNFS表面培養的HUASMC的凋亡比率高于316LSS，通過Real-time PCR檢測細胞凋亡基因，提示HNNFS可能通過外源性和內源性兩種途徑全面介導HUASMC的凋亡，從而抑制平滑肌細胞的增殖。

本文通過細胞增殖率、細胞黏附實驗，對比研究了3種實驗材料對人臍動脈平滑肌細胞增殖情況的影響，實驗數據表明，與L605和316L SS相比，HNNFS對于平滑肌細胞具有顯著的抑制作用。這一觀察結果與上述研究結果一致。本研究的實驗結果和結論尚處于初級階段，支架內再狹窄是一個非常復雜的過程，高氮無鎳不銹鋼材料對支架內再狹窄影響的機理需要進一步研究。

4 結論與展望

目前，包括中國的很多國家已經下調了醫用不銹鋼中Ni的標準含量，并發布了醫用無鎳不銹鋼標準。高氮無鎳不銹鋼作為一種新型的生物醫用材料，由于其不含Ni元素，且具有優異的綜合性能，在多個領域中已經取得重要進展。作為冠脈支架植入材料，高氮無鎳不銹鋼具有良好的血液相容性，同時對血管平滑肌細胞的增殖具有一定的抑制作用，對降低支架植入后引起的再狹窄具有十分重要的意義。

相較傳統不銹鋼，無鎳不銹鋼具有更優異的物理性能、化學性能及生物相容性，近些年仍會是醫用金屬材料的研究熱點。隨著對無鎳不銹鋼的生物安全性和力學性能等相關基礎性研究的不斷深入進行及逐步優化，醫用高氮無鎳不銹鋼將會逐漸取代傳統醫用不銹鋼，推動具有自主知識產權的新型醫用不銹鋼的臨床應用。

[參考文獻]

[1] 《中國組織工程研究與臨床康復》雜志社學術部.醫用金屬材料相關產品的應用現狀和發展趨勢[J].中國組織工程研究,2010,14(51):9621-9622.

[2] Coogan TP,Latta DM,Snow ET,et al.Toxicity and carcinogenicity of nickel compounds[J].Crit Rev Toxicol,1989,19(4):341.

[3] Klein CL,Nieder P,Wagner M,et al.The role of metal corrosion in inflammatory processes:induction of adhesion molecules by heavy metal ions[J].J Mater Sci Mater M,1994,5(11):798-807.

[4] Denkhaus E,Salnikow K.Nickel essentiality, toxicity, and carcinogenicity[J].Crit Rev Oncol Hemat,2002,42(1):35-56.

[5] 任伊賓,楊柯,梁勇.醫用金屬材料中的鎳危害[J].生物醫學工程學雜志,2005,22(5):1067-1069.

[6] Menzel J,Kirschner W,Stein G.High nitrogen containing Ni-free austenitic steels for medical applications[J].Isij International,1996,36(7):893-900.

[7] 楊柯,任伊賓.醫用不銹鋼的研究與發展[J].中國材料進展,2010,29(12):1-10.

[8] Fujiu K,Manabe I,Sasaki M,et al.Nickel-free stainless steel avoids neointima formation following coronary stent implantation[J].Sci Technol Adv Mat,2012,13(6):064218.

[9] Vlahos J,Songer MN,Davenport K.Cannulated bone screw:US,8623060[P].2014.

[10] Cihangir A,Hakan T,?smail E,et al.Relation of nickel allergy with in-stent restenosis in patients treated with cobalt chromium stents[J].Ann Dermatol,2012,24(4):426-429.

[11] Fini M,Aldini N,Torricelli P,et al.A new austenitic stainless steel with negligible nickel content:anin vitroandin vivocomparative investigation[J].Biomaterials,2003,24(27):4929-4939.

[12] Montanaro L,Cervellati M,Campoccia D,et al.No genotoxicity of a new nickel-free stainless steel[J].Int J Artif Organs,2005,28(1):58-65.

[13] 王青川,張炳春,任伊賓,等.醫用無鎳不銹鋼的研究與應用[J].金屬學報,2017,(10).

[14] GB/T 16886.4-2003,醫療器械生物學評價第四部分：與血液相互作用試驗選擇[S].

[15] Scott KL,Lecak JAcker JP.Biopreservation of red blood cells: past,present and future[J].Transfus Med Rev,2005,19(2):127-142．

[16] 汪鐘,鄭植栓.現代血栓病學[M].北京:北京醫科大學、中國協和醫科大學聯合出版社,1997.

[17] 萬鵬.氮對醫用高氮無鎳不銹鋼的生物相容性影響機理研究[D].北京:中國科學院大學,2011.

[18] Libby P,Schwartz D,Brogi E,et al.A cascade model for restenosis. A special case of atherosclerosis progression[J].Circulation,1992,86(6S):47-52.

[19] Forrester JS,Fishbein M,Helfant R,et al.A paradigm for restenosis based on cell biology: clues for the development of new preventive therapies[J].J Am Coll Cardiol,1991,17(3):758-769.

[20] Kear ney M,Pieczek A,Haley L,et al.Histopathology of instent restenosis in patients with per ipheral artery disease[J].Circulation,1997,95:1998.

[21] Koster R,Vieluf D,Kiehn M,et al.Nickel and molybdenum contact allergies in patients with coronary in-stent restenosis[J].Lancet,2000,356(9245):1895.

[22] Hillen U,Haude M,Erbel R,et al.Evaluation of metal allergies in patients with coronary stents[J].Contact Dermatitis,2002,47(6):353-356.

[23] Iijima R,Ikari Y,Amiya E,et al.The impact of metallic allergy on stent implantation: metalallergy and recurrence of in-stent restenosis[J].Int J Cardiol,2005,104(3):319-325.

[24] Saito T,Hokimoto S,Oshima S,et al.Metal allergic reaction in chronic refractory in-stent restenosis[J].Cardiovasc Revasc Med,2009,10(1):17-22.

[25] Li L,An L,Zhou X,et al.Biological behavior of human umbilical artery smooth muscle cell grown on nickel-free and nickelcontaining stainless steel for stent implantation[J].Sci Rep-UK,2016,6:18762.