葡萄砧木品種‘3309M’中microRNA的鑒定

朱旭東，安顏穎，王晨，賈海鋒，房經(jīng)貴*

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/江蘇省果樹(shù)品種改良與種苗繁育工程中心，江蘇南京 210095；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇南京 210095）

內(nèi)源小分子RNA（small RNA，sRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度為19～25 nt的非編碼的重要調(diào)節(jié)分子[1]，其通過(guò)介導(dǎo)靶基因的裂解或抑制靶翻譯在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[2]。microRNA（miRNA）是非編碼的sRNA主要類(lèi)型之一，廣泛地分布在生物有機(jī)體內(nèi)，該類(lèi)sRNA分子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中起著重要作用。通常，它們的表達(dá)展示出不同種之間的發(fā)育時(shí)期或組織的特異性。越來(lái)越多的研究表明，miRNAs可能參與器官的發(fā)育、細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞凋亡等重要過(guò)程[3]。有關(guān)miRNA的鑒定與其功能分析成為生物研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。隨著具有通量大、時(shí)間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)勢(shì)的下一代測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展并成為miRNA識(shí)別與鑒定的高效技術(shù)[4-5]，葡萄屬植物目前已在歐亞與歐美兩個(gè)種群上開(kāi)展了高通量測(cè)序，大批量的挖掘了葡萄種的miRNA[6-7]。但是，迄今為止，在葡萄砧木上尚無(wú)miRNA的相關(guān)研究報(bào)道。

砧木在葡萄種植中的應(yīng)用起源于19世紀(jì)60年代，而隨著葡萄優(yōu)質(zhì)砧木的推廣與應(yīng)用，葡萄嫁接栽培已成為世界各主要葡萄栽培生產(chǎn)國(guó)發(fā)展葡萄和葡萄酒產(chǎn)業(yè)的重要舉措[8-9]，并促進(jìn)了葡萄產(chǎn)業(yè)更好地發(fā)展。因此，有關(guān)葡萄砧木生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理的研究得到了重視。

葡萄砧木miRNA的研究對(duì)砧木抗性機(jī)理的認(rèn)識(shí)具有重要意義。為此，本研究首次構(gòu)建了葡萄砧木‘3309M’的miRNA文庫(kù)，并通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)該miRNA文庫(kù)進(jìn)行深度測(cè)序，分析了葡萄砧木miRNA文庫(kù)的特點(diǎn)，以便于發(fā)現(xiàn)葡萄砧木中參與抗寒、抗病及果實(shí)品質(zhì)發(fā)育的葡萄砧木特異的miRNA，為以后進(jìn)一步分析其功能以及葡萄砧穗互作機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

葡萄砧木‘3309M’（Vitis labrusca）的葉片和根于2016年采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所，所有的樣品采集后立即投入液氮帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存，用于總RNA的提取。

1.2 總RNA、sRNA的提取

RNA提取前所有的槍頭、Eppendorf管均用0.1%DEPC水于37 ℃浸泡過(guò)夜，高壓滅菌，烘干待用。其他玻璃器皿、研缽等按照分子克隆介紹的方法處理。分別按照如下的方法提取葡萄的葉、莖、卷須、花序、花和果實(shí)等器官的總RNA即按照SDS-酚法提取總RNA，并用4 mol/L的LiCl富集LMW RNA。

sRNA 3'末端加ploy(A)的反應(yīng)總體系為25 μL：1.5μg sRNA模板；5 μL 5×buffer；2.5 μL 25 mmol MgCl2；0.25 μL ATP（100 nM/μL）；1 μL PAP（2 U/μL）；DEPC水補(bǔ)足。置于37 ℃，保溫1 h，得到加ploy(A)尾巴的sRNA。加尾后的小分子RNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，后用適量的DEPC水溶解。

1.3 sRNA cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序

1.3.1 5'端與3'端接頭的連接

將“1.2 總RNA、sRNA的提取”獲得的sRNA與1.3 μL 5'端接頭（5'UCAGAGUUCUACAGUCCGACGA UC）、1 μL 10×T4 RNA連接酶緩沖液、1 μL T4 RNA連接酶、1 μL RNA酶抑制劑混合，于20 ℃反應(yīng)6 h。隨后以15% TBE-Urea PAGE膠進(jìn)行分離純化，將長(zhǎng)度為40～60個(gè)核苷酸的條帶切下，粉碎、洗脫、過(guò)濾和沉淀。得到的沉淀用無(wú)RNA酶的6.4 μL純水溶解后，與0.6 μL 3'端接頭（5'UCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGU idT）、1 μL 10×T4 RNA連接酶緩沖液、1 μL T4 RNA連接酶、1 μL RNA酶抑制劑混合，于37 ℃反應(yīng)6 h。連接產(chǎn)物用10% TBE-Urea PAGE膠分離純化：將長(zhǎng)度為70個(gè)核苷酸的條帶切下并按前述步驟回收膠內(nèi)的核酸。得到的核酸沉淀用5 μL無(wú)RNA酶的DEPC水溶解。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄

將獲得的連有3'端和5'端接頭的sRNA產(chǎn)物用SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將4.5 μL產(chǎn)物與1.5 μL反轉(zhuǎn)錄引物（5'CAAGCAGAAGACGGC ATACGA）混合，于65 ℃加熱10 min去除RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，置于冰上。隨后加入2 μL 10×第一鏈緩沖液、1 μL 10mmol/L dNTP、2 μL 100 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）、1 μL RNA酶抑制劑，用DEPC水補(bǔ)至9 μL置于65 ℃溫浴5 min，再加入1 μL SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶，在50 ℃下反應(yīng)1 h。

1.3.3 cDNA文庫(kù)的純化和測(cè)序

獲得的cDNA用15%的TBE-PAGE膠進(jìn)行分離純化，得到的cDNA用Agilent 2100測(cè)定其濃度，最終濃度稀釋到10 nmol/L，用Illumina新一代測(cè)序儀1 G Genome Analyzer系統(tǒng)測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 miRNA的鑒定

通過(guò)Base Callin將原始圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為序列數(shù)據(jù)，即為原始數(shù)據(jù)，并保存在“Fastq”文件中。為獲得高質(zhì)量的序列，從原始序列（raw reads）數(shù)據(jù)中去除接頭序列和質(zhì)量值Q≤5的堿基數(shù)占整個(gè)reads的50%以上的低質(zhì)量序列，將獲得的干凈序列（clean reads）用于數(shù)據(jù)分析。通過(guò)比對(duì)miRBase 21.0庫(kù)中葡萄物種的miRNA序列，得到保守的miRNA。針對(duì)miRNA的生物特征，利用Mireap軟件進(jìn)行非保守的miRNA鑒定。

miRNA表達(dá)量采用TPM（transcripts per million）校準(zhǔn)，計(jì)算公式為：miRNA在文庫(kù)中的歸一化表達(dá)量=（Read count×106）/Total read count。若2個(gè)文庫(kù)中任何1個(gè)miRNA基因的表達(dá)量在歸一化后為0，則被修改為0.01；若2個(gè)文庫(kù)中任何1個(gè)miRNA基因的表達(dá)量在歸一化后小于1，則表示其表達(dá)量較低，不宜進(jìn)行差異表達(dá)分析。根據(jù)公式“差異倍數(shù)（foldchange）＝log2（根文庫(kù)中miRNA的歸一化表達(dá)量/葉片文庫(kù)中miRNA的歸一化表達(dá)量）”計(jì)算根與葉片文庫(kù)miRNA表達(dá)的差異倍數(shù)。

1.5 miRNA靶基因的預(yù)測(cè)

將測(cè)得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和Rfam10.0數(shù)據(jù)庫(kù)中水稻和擬南芥的非編碼RNA進(jìn)行比對(duì)，并將sRNA的特異序列（unique reads）與miRBase 21.0數(shù)據(jù)庫(kù)中所有植物的序列進(jìn)行BLASTn比對(duì)，只有完全匹配的序列才是保守的miRNA。根據(jù)上述分析結(jié)果確定根和葉片文庫(kù)中已知的miRNA數(shù)量，對(duì)已知的差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行分析，以foldchange≥1且FDR≤0.05作為miRNA顯著差異表達(dá)的篩選條件。

對(duì)差異表達(dá)的miRNA利用psRNATarget進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，并使用BLAST軟件將靶基因序列與NR（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、Swiss-Prot（http://www.uniprot.org/）、GO（http://www.geneontology.org/）、COG（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）、KEGG（http://www.kegg.jp/）、KOG（Clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes）、Pfam（http://pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得靶基因的注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄砧木sRNA的測(cè)序分析

高通量測(cè)序結(jié)果表明：葡萄砧木根和葉片文庫(kù)中sRNA的原始序列分別有12 633 906和12 686 708條；去除接頭序列、poly-A序列、≤18 nt序列和低質(zhì)量序列后，干凈序列分別有12 174 719和12 397 993條。在根和葉片文庫(kù)中，sRNA的特異序列分別有2 772 037和1 676 324條（表1），其中，能與基因組比對(duì)成功的sRNA特異序列分別有949 559和633 100條，分別占各自sRNA特異序列總數(shù)的34.2%和37.8%。

由表1可見(jiàn)，葡萄砧木‘3309M’根和葉片文庫(kù)中sRNA類(lèi)型較多，包括miRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、tRNA和重復(fù)序列。其中，根和葉片文庫(kù)中未注釋的sRNA序列分別有1 597 233和1 070 626條，分別占各自sRNA特異序列總數(shù)的57.62%和63.87%，在已注釋的sRNA中，rRNA最多，分別占根和葉片文庫(kù)中sRNA特異序列總數(shù)的31.61%和22.67%；其次為tRNA，分別占各自sRNA特異序列總數(shù)的3.53%和2.53%；miRNA較少，分別僅占各自sRNA特異序列總數(shù)的0.47%和0.81%。

2.2 葡萄砧木中保守miRNA的鑒定

為了鑒定葡萄中保守的miRNA，深度測(cè)序的小分子RNA序列與目前miRBase 21.0已知的植物保守miRNA的進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，通過(guò)高通量測(cè)序鑒定了葡萄砧木根和葉片中文庫(kù)分別包含104個(gè)和90個(gè)miRNA家族，共181條miRNA，并且這些鑒定的保守miRNA不同家族成員的數(shù)量存在重要的差異，其中大多數(shù)的家族僅包含幾個(gè)成員，而有4個(gè)家族（miR169、miR395、miR171和miR156）卻分別包含25、13、10和9個(gè)等多個(gè)成員，還有一些家族只有一個(gè)成員如miR162、miR168（圖1）。不同miRNA家族的讀數(shù)（read count）也存在劇烈變化，其變化范圍從1到413 112次（圖2）。在葡萄砧木保守miRNA中，miR159、miR166、miR396和miR482具有最多的讀數(shù)，而另外10條miRNA家族的讀數(shù)很低。這些miRNA表達(dá)豐度的劇烈變化，能夠進(jìn)一步反映出這些miRNA可能在葡萄砧木生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控功能存在重要差異。

表1 葡萄砧木sRNA的組成Table 1 Composition of small RNA in grapevine rootstock

分析葡萄砧木保守miRNA長(zhǎng)度的結(jié)果（圖3）可知，長(zhǎng)度為21 nt的miRNA所占比例最高，為69.45%；長(zhǎng)度為20 nt和22 nt的miRNA所占比例相當(dāng)，為11.63%和12.65%。總體上看，在葡萄砧木miRNA中，長(zhǎng)度為20～22 nt的miRNA所占比例較高，為93.23%。

圖1 葡萄砧木保守miRNA不同家族的成員數(shù)量Figure 1 Numbers of members of each conserved miRNA families in grapevine rootstock

圖2 葡萄保守miRNA不同家族成員的讀數(shù)Figure 2 Numbers of identified miRNAs in each conserved miRNAs family in grapevine rootstock

對(duì)葡萄砧木保守miRNA堿基偏好性進(jìn)行分析（圖4），結(jié)果表明，保守miRNA的第一個(gè)堿基偏好U，比例達(dá)到71%，說(shuō)明該測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。

2.3 葡萄砧木中miRNA靶基因功能的預(yù)測(cè)

充分認(rèn)識(shí)miRNA的靶基因?qū)⒂兄谖覀兩钊肜斫鈓iRNA調(diào)控基因的范圍以及更廣泛地描述這些miRNA功能的重要性。本研究根據(jù)miRNA與其靶基因之間近乎完全或完全的互補(bǔ)性以及一些靶基因預(yù)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測(cè)了25個(gè)miRNA家族總共412個(gè)靶基因。將預(yù)測(cè)到的412個(gè)葡萄砧木根和葉片中miRNA的靶基因分別在Swiss-Prot、GO、KEGG、COG、KOG、Pfam和NR數(shù)據(jù)中進(jìn)行功能注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)分別有354、147、95、190、248、373和412個(gè)靶基因得到注釋。

圖3 保守miRNA的長(zhǎng)度分布圖Figure 3 Size distributions of conserved miRNA sequences from grapevine rootstock

圖4 miRNA各位點(diǎn)堿基分布圖Figure 4 The bias distribution of nucleotide base in each position of miRNA sequences

圖5 葡萄砧木中鑒定的保守miRNA靶基因的GO功能分類(lèi)結(jié)果Figure 5 GO classification of conserved miRNA target genes identified in grapevine rootstock

利用GO功能分類(lèi)對(duì)葡萄砧木根和葉片鑒定的保守miRNA靶基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)（圖5），結(jié)果表明：大部分差異表達(dá)miRNA靶基因的功能主要集中在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3方面。細(xì)胞組分中，細(xì)胞、細(xì)胞部分和細(xì)胞器中的差異表達(dá)miRNA靶基因較多；在分子功能中，多數(shù)差異表達(dá)miRNA靶基因與結(jié)合功能及催化活性有關(guān)，與核苷酸結(jié)合有關(guān)的miRNA靶基因最多；在生物過(guò)程中，差異表達(dá)miRNA靶基因的功能主要集中在代謝過(guò)程（Metabolic process）、細(xì)胞過(guò)程（Cellular process）、單一生物過(guò)程（Single-organism process）、生物調(diào)節(jié)（ Biological regulation）、響應(yīng)刺激（Response to stimulus）等。

對(duì)葡萄砧木根和葉片中鑒定的保守miRNA靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析（圖6）。結(jié)果顯示：富集差異表達(dá)miRNA靶基因數(shù)量最多的通路依次為核糖體（Ribosome）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、RNA運(yùn)輸（RNA transport）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)（Protein processing in endoplasmic reticulum）、糖酵解/糖異生（Glycolysis/Gluconeogenesis）等，富集的差異表達(dá)miRNA靶基因數(shù)分別為206、199、181、161、153和145個(gè)。

圖6 葡萄砧木中鑒定的保守miRNA靶基因的KEGG通路富集分析的結(jié)果Figure 6 KEGG enrichment analysis of conserved miRNA target genes identified in grapevine rootstocks

依據(jù)同源基因的功能注釋?zhuān)覀儼堰@些靶基因分為三大類(lèi)：最大的一類(lèi)是轉(zhuǎn)錄因子，其參與植物的生長(zhǎng)、發(fā)育以及由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)型；第二大類(lèi)是編碼不同的酶蛋白基因，其主要涉及在不同的代謝過(guò)程如ATP、sulfurylase/APS kinase、ATP synthase等；第三類(lèi)與免疫反應(yīng)（NLA）、脅迫反應(yīng)（CWP3）、抗病反應(yīng)（NBSLRR）以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ARF、AFB）等過(guò)程相關(guān)。大多數(shù)潛在的靶基因預(yù)測(cè)的功能與蘿卜[10]、枳[11]、番茄[12]和擬南芥[13]等植物上鑒定的功能基本一致，表明不同植物中的靶基因的功能具有較高的保守性。

2.4 葡萄砧木根和葉片中顯著差異表達(dá)miRNA的篩選

進(jìn)一步的分析結(jié)果（表2）表明：以foldchange≥1且FDR≤0.05作為篩選條件，確定顯著差異表達(dá)的miRNA家族有32個(gè)，共87條miRNA家族成員，其中54條miRNA在葉片文庫(kù)上調(diào)表達(dá)（分別屬于vvimiR167a、vvi-miR156f、vvimiR156i、vvi-miR156g、vvimiR172d等成員），33條miRNA下調(diào)表達(dá)。

2.5 葡萄砧木中新的miRNA的鑒定

表2 葡萄砧木根和葉片中顯著差異表達(dá)miRNA的表達(dá)特性分析Table 2 Analysis on the expression of miRNA in grape rootstocks roots and leaves

續(xù)表2 Continued table 2

針對(duì)miRNA的生物特征，對(duì)于比對(duì)到參考基因組的序列，利用Mireap軟件進(jìn)行非保守的miRNA鑒定。測(cè)序序列比對(duì)到參考序列，通過(guò)堿基數(shù)目延伸，獲得潛在前體序列，對(duì)前體序列進(jìn)行miRNA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，獲得新的非保守的miRNA。本研究發(fā)現(xiàn)了104條新的miRNA，其前體均能夠被折疊成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在這些新的miRNA中，有32條新的miRNA的5'末端以U開(kāi)頭，而另外53條miRNA的5'末端以A開(kāi)頭（在雙鏈RNA中A互補(bǔ)于U），這些是miRNA序列結(jié)構(gòu)的重要特征。所有這些分析結(jié)果有力地證明了葡萄砧木中新的miRNAs的真實(shí)性。

研究發(fā)現(xiàn)，新的非保守的miRNAs被測(cè)序到的讀數(shù)（rea count）通常比保守的miRNA的數(shù)量要少，只有25條miRNA的序列的讀數(shù)達(dá)到10次（表3）。這些結(jié)果與山葡萄和鮮食葡萄中的研究報(bào)道相一致[14-16]，大多數(shù)新的特異的miRNA通常比保守miRNA的表達(dá)水平低，且具有時(shí)空的特異性。基因組定位分析表明，這些新的miRNA均定位在葡萄第10、11、12和13條染色體，分別有24、22、26和32條miRNA，可以看出其在染色體上的分布是不均勻的。

3 討論和結(jié)論

3.1 葡萄砧木保守miRNA的鑒定

大多數(shù)成熟的miRNA在不同植物中具有較高的保守性[1,3]。這能為預(yù)測(cè)不同植物中的同源miRNA提供有力證據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)山葡萄與野生葡萄等不同品種中保守的和新的miRNA的數(shù)量與種類(lèi)具有顯著差異[14-16]，表明葡萄的不同品種、不同組織中miRNA文庫(kù)存在自身特點(diǎn)，有必要在不同葡萄種質(zhì)的不同組織中開(kāi)展高通量測(cè)序，以便能夠發(fā)現(xiàn)更多種類(lèi)和數(shù)量的miRNA。

表3 葡萄砧木中鑒定的新的miRNATable 3 Novel miRNA identified in grapevine rootstock

本研究構(gòu)建了葡萄砧木品種‘3309M’根和葉組織的小RNA文庫(kù)，鑒定了181條保守的和104條非保守的miRNA。葡萄砧木根和葉片中共有32個(gè)miRNA家族共87條顯著差異表達(dá)，其中vvi-miR167a、vvi-miR166b、vvimiR162和vvi-miR156等54條miRNA上調(diào)表達(dá)，其余33條miRNA下調(diào)表達(dá)。不同植物中的miRNA存在一定差異。本研究中，葡萄砧木根和葉片中miRNA長(zhǎng)度均以21 nt為主。相關(guān)研究結(jié)果顯示，蘿卜中的miRNA長(zhǎng)度以21 nt和24 nt為主[10]；枳和番茄的miRNA長(zhǎng)度以21 nt為最多[11-12]，而擬南芥中的miRNA長(zhǎng)度則以24 nt為最多[13]，但與鮮食和野生葡萄中miRNA的長(zhǎng)度分布一樣[14-16]，表明不同植物的miRNA長(zhǎng)度存在差異，可能與植物種類(lèi)及參與miRNA生物合成的酶不同有關(guān)。

3.2 葡萄砧木保守miRNA的靶基因

為了鑒定植物miRNA的功能，進(jìn)一步確定其靶基因非常必要。目前，植物上靶基因預(yù)測(cè)最有效的工具是基于miRNA與靶基因高度同源性的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法。本研究利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了葡萄砧木中保守miRNA的靶基因，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的大多數(shù)靶基因是植物特異的轉(zhuǎn)錄因子，如AP2、NAC、SBP、NF-YA、GRAS、Zincnger（C2H2）和ARF等，與鮮食葡萄和野生葡萄中miRNA靶基因類(lèi)似，表明miRNA功能的保守性。本研究中，葡萄砧木根和葉片中miRNA靶基因的功能主要集中在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化磷酸化、RNA運(yùn)輸、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)運(yùn)輸、糖酵解/糖異生等方面，這可能與葡萄砧木的抗性較強(qiáng)有關(guān)。葡萄砧木miRNA的靶基因功能注釋表明它們?cè)谄咸训纳L(zhǎng)、發(fā)育及對(duì)環(huán)境脅迫反應(yīng)的應(yīng)答過(guò)程中起著重要作用，開(kāi)展進(jìn)一步的研究有助于更廣泛地理解miRNA在葡萄砧木生長(zhǎng)發(fā)育中的功能。

3.3 葡萄砧木中新的miRNA的預(yù)測(cè)

本研究根據(jù)miRNA的特征如前體典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，共預(yù)測(cè)了104條非保守的新的miRNA。所有這104條新的miRNA的前體都能夠折疊成典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)并滿(mǎn)足miRNA的預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。只有25條新的miRNA的讀數(shù)達(dá)到10次以上。所有這些結(jié)果證明，這104條新的miRNA在葡萄砧木中確實(shí)存在。新的miRNA在葡萄砧木特定組織的特異表達(dá)能夠?yàn)檠芯克鼈兊纳砉δ芴峁┲匾畔ⅰＦ咸颜枘咎禺惖膍iRNA在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的詳細(xì)功能仍有待我們?nèi)嫔钊氲仃U述。

[1] PHILLIPS J, DALMAY T, BARTELS D. The role of small RNAs in abiotic stress[J]. FEBS Letters, 2007, 581(19): 3592-3597.

[2] LI Y, ZHENG Y, ADDO-QUAYE C, et al. Transcriptome-wide identification of microRNA targets in rice[J]. Plant Journal, 2010,62(5): 742-759.

[3] ZENG C Y, WANG W Q, ZHENG Y, et al. Conservation and divergence of microRNAs and their functions in Euphorbiaceous plants[J]. Nucleic Acids Research, 2010, 38(3): 981-995.

[4] YU H P, SONG C N, JIA Q D, et al. Computational identification of microRNAs in apple expressed sequence tags and Validation of their precise sequences by miR-RACE[J]. Physiologia Plantarum, 2011, 141(1): 56-70.

[5] SONG C N, WANG C, ZHANG C Q, et al. Deep sequencing discovery of new and conserved microRNAs in trifoliate orange(Citrus trifoliate)[J]. BMC Genomics, 2010(11): 431.

[6] PANTALEO V, SZITTYA G, MOXON S, et al. Identification of grapevine microRNAs and their targets using high-throughput sequencing and degradome analysis[J]. Plant Journal, 2010,62(6): 960-976.

[7] MICA E, PICCOLO V, DELLEDONNE M, et al. Correction:high throughput approaches reveal splicing of primary microRNA transcripts and tissue specific expression of mature microRNAs in Vitis vinifera[J]. BMC Genomics, 2010(11): 109.

[8] 袁園園, 姚玉新, 王文軍, 等. 葡萄嫁接栽培研究現(xiàn)狀與展望[J].中外葡萄與葡萄酒, 2012(6): 57-61.

[9] RASHEDY A. Response of two grape rootstocks to some salt tolerance treatments under saline water conditions[J]. Journal of Horticultural Science & Ornamental Plants, 2010, 2(2): 93-106.[10] SUN X C, XU L, WANG Y, et al. Identification of novel and salt responsive miRNAs to explore miRNA-mediated regulatory network of salt stress response in radish (Raphanus sativus L.)[J].BMC Genomics, 2015(16): 197.

[11] ZHANG X N, LI X, LIU J H. Identification of conserved and novel cold-responsive microRNAs in trifoliate orange (Poncirus trifoliate (L.) Raf.) using high-throughput sequencing[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 2014, 32(2): 328-341.

[12] MOXON S, JING R C, SZITTYA G, et al. Deep sequencing of tomato short RNAs identifies microRNAs targeting genes involved in fruit ripening[J]. Genome Research, 2008, 18(10):1602-1609.

[13] KASSCHAU K D, FAHLGREN N, CHAPMAN E J, et al.Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs[J].PLoS Biology, 2007, 5(3): e57.

[14] WANG C, WANG X, NICHOLAS K, et al. Deep sequencing of grapevine flower and berry short RNA library for discovery of novel microRNAs and validation of precise sequences of grapevine microRNAs deposited in miRBase[J]. Physiologia Plantarum, 2011. 143(1): 64-81.

[15] WANG C, HAN J, LIU C, et al. Identification of microRNAs from Amur grapes (Vitis amurensis Rupr.) by deep sequencing and analysis of microRNA variations with bioinformatics[J].BMC Genomics, 2012(13): 122.

[16] WANG C, HAN J, NICHOLAS K, et al. The characterization of target mRNAs for table grapevines miRNAs with an integrated strategy of modified RLM RACE, PPM RACE and qRT-PCRs of cleavage products[J]. Journal of Plant physiology, 2013,170(10): 943-957.