群多普利對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用研究

周剛，王佳君

腦缺血再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程，最近研究發現，腦血流中斷和再灌注使腦的細胞產生損傷是一個快速的級聯反應，這個級聯反應包括許多環節，如能量障礙、細型，上海博訊醫療設備廠；BI-2000圖像分析系統：成都泰盟科技有限公司；酶標儀：Genios TECAN公司，奧地利。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組及給藥 將健康雄性SD大鼠隨機分成模型組、假手術組、群多普利低劑量組（5 mg/kg）、群多普利高劑量組（10 mg/kg），12只/組；腹腔注射給藥，模型組、假手術組給予同劑量的生理鹽水，每天1次，連續給藥6 d。第6天給藥后1 h建立缺血再灌注模型。

1.4.2 腦缺血/再灌注動物模型的制備 采用改良ZeaLonga's法制作大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MACO）模型[2]。大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸部正中線切口，沿胸鎖乳突肌內緣鈍性分離肌肉和筋膜，直到分離出左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，用動脈夾暫時夾閉頸內動脈，結扎頸外動脈近心端及頸總動脈，然后在距頸總動脈近分叉3～4 mm處剪口，按體重選取適當直徑自制線栓（參照范圍：180～230 g：0.235 mm；230～260 g：0.26 mm；＞260 g：0.28 mm）自切口輕輕插入，插入深度（從頸內、外動脈分叉處計起）約為18～20 mm，固定魚線，縫合皮膚。缺血2 h后，將栓塞線向外輕輕拔出10 mm左右，抽拉出至頸內、外動脈分叉進行復灌。假手術組按上述方法，分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈后，插入栓塞線僅至頸內、外動脈分叉處，而不阻塞大腦中動脈。復灌24 h進行后續試驗。

1.4.3 模型的鑒定 模型制備過程中，應用SA5600自動血流變儀檢測大鼠大腦中動脈血流改變；如圖1所示，大鼠MCAO模型可顯著減少大腦中動脈血流量；復灌后，大腦中動脈血流量基本恢復；大鼠清醒后，觀察MCAO后的神經行為特征的變化，即出現下面體征者表明模型制作成功[2]：①大鼠大腦中動脈栓塞側（本實驗栓塞右側）出現Horner征，表現為瞳孔縮小，眼裂變小。②軀體向對側屈曲，大鼠不能充胞酸中毒、興奮性氨基酸釋放增加、細胞內鈣失穩態、自由基生成、凋亡基因激活等。這些環節互為因果，彼此重疊，并相互聯系，形成惡性循環，最終導致細胞凋亡或壞死[1]。近年來研究表明，炎癥在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用，腦缺血再灌注后內皮細胞炎癥反應使血腦屏障受損，加重了腦損害及腦水腫。近期研究表明，腎素-血管緊張素轉換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）類藥物具有抗炎[2]、抑制組織纖維素樣壞死、抑制金屬基質蛋白酶（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）的活性等藥理作用[3]，因此研究抑制腦缺血后炎癥反應，可能成為治療腦缺血損傷的有效方法。本實驗采用大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，探究群多普利對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其對炎癥反應相關因子白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康SD大鼠48只，體重220～260 g，購于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心。動物許可證號：SCXK（鄂）2010-0007。大鼠自由進食、飲水，適應性飼養7 d后進行實驗，所有動物實驗操作均符合華中科技大學動物倫理委員會有關條例規定。

1.2 藥品與試劑 群多普利購自美國的USP對照品（批號：FOH140），2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）購于中國醫藥（集團）上海化學試劑公司；IL-1β及IL-10免疫酶聯吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購于美國R&D公司。

1.3 主要實驗儀器 SA5600自動血流變儀：北京賽科西德公司；pH計：DELTA320，梅特勒（上海）有限公司；臺式高速低溫離心機：TGL-16A，長沙平凡儀器儀表公司；恒溫水槽：SSW分伸展左前肢，提尾時軀體向左轉，右側前后肢外展，左側前后肢松軟屈曲。③運動時出現追尾征：運動時軀體向一側傾斜、旋轉。假手術組會出現Horner征，但無左前肢屈曲和追尾征。④缺血腦組織切片，TTC染色，可見蒼白色的缺血區域。

1.4.4 神經癥狀評分標準 大鼠清醒后，觀察其行為學變化，神經癥狀按Longa 5分制評分[2]。評分標準：無神經損傷，0分；不能完全伸展左側肢體，前肢為甚，1分；向左轉圈，2分；行走時向左側傾倒，3分；不能自發行走，意識昏迷，4分。分數越高，表示動物神經功能障礙越嚴重。

1.4.5 TTC染色及腦梗死體積的測定 大鼠MCAO 2 h再灌注24 h后，迅速斷頭取腦，沿冠狀面切成6片（每片約2 mm），立即置于2%TTC磷酸鹽緩沖液中，37℃避光溫浴30 min。取出腦片置10%福爾馬林液中固定，正常腦組織為玫瑰紅色，梗死部位為白色。應用BI-2000圖像分析系統分析計算腦梗死體積占全腦體積的百分比。

1.4.6 ELISA檢測腦組織IL-1β及IL-10含量 大鼠MCAO 2 h再灌注24 h后，迅速斷頭取腦，立即置于冰盤上，取梗死交界區腦組織，用冰凍生理鹽水制備20%腦勻漿，2500 r/min離心10 min，取上清，-80℃保存用于IL-1β及IL-10含量的測定，具體操作步驟按IL-1β及IL-10 ELISA檢測試劑盒說明書進行，各因子含量以每克蛋白所含細胞因子皮克數表示，即pg/g（pro）[4-5]。

1.5 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件分析數據，所有數據以表示，多組資料采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 群多普利對缺血再灌注損傷大鼠神經功能評分的影響 缺血再灌注損傷大鼠神經功能評分為（2.67±0.21）分；群多普利低劑量和高劑量組大鼠神經功能評分分別降至（1.75±0.25）分（P＜0.05）及（1.60±0.39）分（P＜0.05）（表1）。

2.2 群多普利對缺血再灌注損傷大鼠腦梗死體積的影響 群多普利低劑量和高劑量均可顯著降低大鼠腦梗死體積百分比（表2和圖2）。

2.3 群多普利對缺血再灌注損傷大鼠腦組織IL-1β及IL-10含量的影響 缺血再灌注損傷大鼠腦梗死交界區腦組織的IL-1β及IL-10含量分別為（6.77±0.94）pg/g（pro）及（8.68±0.78）pg/g（pro）；群多普利低劑量組和高劑量組大鼠腦組織IL-1β的含量分別下降至（4.53±1.06）pg/g（pro）（P＜0.05）及（4.01±0.89）pg/g（pro）（P＜0.01）；群多普利高劑量使大鼠腦組織IL-10的含量增加至（12.83±0.92）pg/g（pro）（P＜0.05）。

圖1 大鼠缺血前后及再灌注后大腦中動脈血流改變

表1 各組大鼠神經神經功能損傷評分及腦梗死體積

3 討論

本實驗結果表明，群多普利可顯著減小大鼠腦缺血再灌注損傷所致的腦梗死體積，改善神經功能預后。

缺血再灌注損傷涉及極其復雜的病理生理過程，其中各個環節、各種影響因素間的相互作用尚未完全闡明。目前認為，其主要機制包含興奮性氨基酸毒性、自由基及脂質過氧化、線粒體功能障礙、Ca2+超載及由上述因素引起的一系列致炎因子（IL-1、腫瘤壞死因子-α、IL-6等）和抗炎癥因子（IL-10、轉化生長因子、神經生長因子等）表達失衡。上述各環節可以相互影響，相互促進，導致病情的進一步惡化。腦缺血損傷的最終發展方向主要是炎癥反應引起的細胞壞死和凋亡。因此，控制腦缺血過程中的炎癥反應，阻斷惡性循環的關鍵環節，對改善腦缺血癥狀及預后有重要意義。

表2 群多普利對缺血再灌注損傷大鼠腦組織IL-1β及IL-10含量的影響

圖2 群多普利對缺血再灌注損傷大鼠腦梗死體積的影響

IL-1β為一種致炎細胞因子，廣泛參與了人體組織破壞、水腫形成等多種病理損傷過程。研究表明，IL-1β可加重腦缺血引起的腦水腫及中性粒細胞的浸潤[6]，IL-1β受體拮抗劑IL-1RA可減少MCAO大鼠腦梗死[7]；在腦缺血損傷的炎癥反應中，效應細胞在產生促炎細胞因子的同時，也會合成分泌大量的抑炎細胞因子，兩者之間互相作用，決定著炎癥反應的發展方向。IL-10是Th2型細胞因子中最重要的抗炎細胞因子，在細胞因子網絡中發揮著極其重要的作用，其可下調主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅱ型抗原、共刺激分子B7和黏附分子的表達，抑制抗原的遞呈過程，直接抑制T細胞的增殖；此外，IL-10能抑制炎癥細胞因子如IL-1、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α及一氧化氮、自由基、前列腺素等炎性調節因子的分泌，進而保護宿主免受過度的免疫及炎癥反應。已有研究表明，IL-10可顯著減少大腦中動脈急性閉塞所致的腦梗死的體積[8]。

研究表明，在腦缺血再灌注損傷過程中血管緊張素Ⅱ作為一個致炎因子發揮著重要作用，動物實驗表明，短暫性全腦缺血后及給予血管緊張素Ⅱ可增加腦水腫程度[9]，給予血管緊張素受體阻滯劑或血管緊張素Ⅱ抗體可以顯著減少腦梗死面積、提高神經功能預后[10-12]，然而，其具體機制尚不清楚。本實驗發現，缺血再灌注損傷大鼠腦組織內IL-1β及IL-10含量均顯著增加，IL-1β的增加提示缺血再灌注損傷可誘發炎癥反應導致神經元損傷；IL-10的增加提示可能存在一種內源性的保護機制；顯而易見，此時的致炎因子與抗炎因子處于失衡狀態；給予5 mg/kg及10 mg/kg群多普利均可明顯改善腦缺血再灌注大鼠的神經功能評分，減少腦梗死體積，同時抑制IL-1β的分泌，高劑量的群多普利（10 mg/kg）可進一步提高IL-10的分泌。上述結果提示，低劑量的群多普利主要是抑制炎癥因子IL-1β的分泌，而較高劑量時既可抑制炎癥因子IL-1β的分泌，又可增加抗炎因子IL-10的分泌。

本實驗結果初步提示，在腦缺血再灌注損傷雄性大鼠中，群多普利可能通過調節IL-1β及IL-10的分泌，重建促炎因子與抗炎因子之間的平衡，從而起到神經保護作用。但是本實驗尚存在一定的局限性：①為了排除雌激素對腦缺血的保護作用，本實驗僅選取雄性大鼠為研究對象；②有關群多普利對炎性因子的調控機制尚有待進一步探究。

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