NOD1 rs2075819A>G和rs2075820G>A遺傳變異與肺癌發病的關系

董靜，楊振邦，劉沖，劉睿，張雪梅，張志

(1華北理工大學附屬唐山工人醫院，河北唐山063000；2華北理工大學生命科學學院)

模式識別受體是進化保守的機體先天性免疫系統感受器，通過識別外源致病物(病原體相關分子模式)和內源致病物(損傷相關分子模式)激活胞內特異的信號途徑，進而啟動免疫應答。目前發現有5個模式識別受體家族，包括Toll受體、核苷酸結合寡聚域樣受體(NOD)、AIM受體、GIG-1受體(RLRs)和C型凝集素受體。若模式識別受體信號失調，會導致感染、炎癥和腫瘤發生[1]。NOD1是NLRs家族的重要一員，廣泛表達于胚胎和成體的多種組織細胞中[2]，定位于細胞質和細胞膜[3]。NOD1天然識別一種稱為GM-TriDAP(GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-mesoDAP)的肽聚糖結構，這種結構存在于絕大多數革蘭陰性菌和部分革蘭陽性菌的胞壁中，其中，iE-DAP(γ-D-Glu-mesoDAP)是NOD1的最小活性配體[4]。除了直接結合細菌病原體(外源致病物)外，NOD1受體還可感知Rho GTPases活性改變[5]、細胞骨架組裝異常[3]、內質網應激[6]和病毒寄生蟲入侵[7](均為內源致病物)，從而啟動先天性免疫應答，并與惡性腫瘤[8]的發生密切相關。

肺癌是目前嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤[9]。目前認為,肺結核、肺炎、哮喘和慢性阻塞性肺疾病等炎性肺部疾病可能是肺癌發生發展的誘因[10]，提示模式識別受體基因多態性可能賦予個體對環境不同的敏感度，進而影響罹患肺癌的風險。研究表明，NOD1基因多態性可影響多種腫瘤發病風險[11,12]，但關于NOD1基因多態性與肺癌易感性之間的關系少見報道。本研究旨在探討NOD1基因rs2075819A>G和rs2075820G>A遺傳變異與肺癌發病的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2008年3月～2012年12月在唐山市工人醫院經病理檢查確診的原發性肺癌患者706例(病例組)，男471例、女235例，年齡平均59.26歲，腺癌404例(57.2%)、鱗狀細胞癌273例(38.7%)，其他類型29例(4.10%)(腺鱗癌15例，支氣管肺泡癌9例和大細胞肺癌5例)，吸煙者316例(44.8%)，吸煙量平均22.36支/d，非吸煙者390例(55.2%)；選擇同一時期該院的體檢健康者706例作為對照組，男474例、女232例，年齡平均59.05歲。吸煙者200例(28.3%)，吸煙量平均25.64支/d，非吸煙者506例(71.7%)。既往無腫瘤史。病例組與對照組性別、年齡分布差異均無統計學意義。病例組較對照組有更多的吸煙者(P<0.01)。用查閱病歷資料結合問卷調查方式收集研究對象一般人口學資料及臨床病理資料，并獲得知情同意。本研究獲得華北理工大學倫理委員會批準。

1.2 NOD1基因rs2075819A>G和rs2075820G>A遺傳變異的基因分型 采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性分析(PCR-RLFP)法。DNA提取：收集研究對象的外周靜脈血2 mL，采用北京天根生化科技有限公司提供的DNA提取試劑盒提取DNA。NOD1 rs2075819上游引物：5′-GCAACTCGCAGATGCCTAC-3′，下游引物：5′-CATTCCCATACTTCCAAAG-3′。NOD1 rs2075820上游引物：5′-CACGGGCCGGCTAGACGCAGGGGT-3′，下游引物：5′-AGGCGCGCAGGTGGCTGGGGGAGA-3′。PCR反應體系為11 L，含上下游引物各0.3 L(10 mmol/L)，基因組DNA 1～100 ng，2×PCR mix(2×Es Taq MasterMix，康為世紀生物科技公司)6 L，加水補足。PCR反應條件：94 ℃、3 min，94 ℃、40 s，56 ℃、1 min(rs2075819)/65 ℃、1 min(rs2075820)，72 ℃、30 s，共35個循環，72 ℃、3 min。酶切反應體系為10 L，含PCR產物6 L，10×CutSmart Buffer(NEB公司)1 L，FBS(Gibco公司)0.1 L，限制性內切酶BsmFⅠ(rs2075819，NEB公司)0.1 L/BseRⅠ(rs2075820，NEB公司)0.25 L，加水補足。酶切條件為65 ℃水浴2 h(rs2075819)/37 ℃水浴3 h(rs2075820)。酶切產物于2%瓊脂糖凝膠電泳進行基因型判斷和分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。計數資料以頻次或百分比表示,比較采用χ2檢驗;用Logistic回歸分析評價NOD1基因rs2075819A>G和rs2075820G>A變異與肺癌遺傳易感性之間的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因型判讀 NOD1 rs2075819A>G酶切后三種基因型：AA基因型產生一個338 bp的片段；AG基因型產生338 bp、247 bp和91 bp三個片段；GG基因型產生247 bp和91 bp兩個片段。NOD1 rs2075820 G>A酶切后三種基因型：AA基因型產生一個419 bp片段；GA基因型產生419 bp、267 bp和152 bp三個片段；GG基因型產生267 bp和152 bp兩個片段。每個檢測單元均設立陰性對照及兩個以上隨機重復樣本進行質量控制，并于總樣本中隨機抽取30個進行測序驗證。

2.2 NOD1基因rs2075819A>G和rs2075820G>A遺傳變異與肺癌發病風險的關系 Logistic回歸分析表明，與NOD1 rs2075819AA基因型攜帶者相比，rs2075819AG基因型攜帶者發生肺癌的風險降低(OR=0.79，95%CI=0.63～0.99,P<0.05)。而NOD1 rs2075820各基因型在兩組的分布差異無統計學意義(P均>0.05)。

2.3 NOD1基因rs2075819A>G和rs2075820G>A遺傳變異對肺癌發病影響的分層分析 年齡分層顯示，在≤60歲組中，rs2075819 AG基因型攜帶者具有較低的肺癌發病風險(OR=0.69，95%CI=0.51～0.94，P=0.018)，而在>60歲組中差異無統計學意義(P>0.05)。吸煙分層顯示，在不吸煙者中，rs2075819 AG基因型攜帶者具有較低的肺癌發病風險(OR=0.74，95%CI=0.56～0.98，P=0.037)。見表1。rs2075820G>A遺傳變異在年齡和吸煙分層中差異均無統計學意義。見表2。

表1 NOD1 rs2075819A>G遺傳變異與肺癌發病風險關系分層研究

表2 NOD1 rs2075820G>A遺傳變異與肺癌發病風險關系分層研究

3 討論

NOD1基因位于人染色體7p14-15，編碼953aa，蛋白由3段結構域構成：C端亮氨酸重復序列結構域，直接識別外源致病物和內源致病物[13]；中央核苷酸結合寡聚化結構域，具有天然ATP酶活性，負責與配體結合后發生自身寡聚化，從而招募下游信號蛋白[14]；N端半胱天冬酶募集結構域(CARD)，與適配蛋白RIP2通過同型CARD-CARD相互作用激活神經生長因子κB、絲裂原激活的蛋白激酶和干擾素刺激基因因子3等信號通路及轉錄因子激活蛋白1[15,16]，進而啟動免疫應答，介導炎癥反應。通過分析癌癥基因數據庫數據信息，我們發現，NOD1在肺腺癌和肺鱗癌中均呈現顯著性低表達，盡管有研究顯示乳腺癌細胞中低表達的NOD1可能通過抑制腫瘤細胞凋亡的形式而促進腫瘤生長[8]，但這種失調對于肺癌發生發展的影響機制尚不明確，也可能是弱化機體免疫對肺癌細胞的監控，從而促進肺癌細胞的生存和發展[17]。

本研究首次發現，NOD1基因rs2075819A>G變異影響中國北方人群非小細胞肺癌發病風險，與NOD1rs2075819AA基因型攜帶者相比，rs2075819AG基因型攜帶者具有較低的肺癌發病風險。通過年齡分層分析，我們發現在≤60歲者中，rs2075819AG基因型攜帶者具有較低的肺癌發病風險，而在>60歲者中差異無統計學意義，這個結果同M?ckelmann等[11]在德國人群中對結直腸癌的研究結果一致，顯示僅在<50歲組中，rs2075819A>G會降低結直腸癌發病風險。NOD1 rs2075819位于NOD1基因第5號內含子中，該位點多態性的功能意義不十分清楚，可能位于剪接元件中影響轉錄本的剪接效率。此外，我們同時對NOD1 rs2075820G>A對非小細胞肺癌遺傳易感性的影響進行了研究，未發現具有相關性。這與M?ckelmann等[11]的研究結果不一致，提示NOD1 rs2075820遺傳變異可能在不同人種、不同組織中具有不同的作用機制。NOD1 rs2075820G>A(也稱NOD1 E266K)位于NOD1基因第6號外顯子中，G>A變異使編碼谷氨酸變為賴氨酸，導致氨基酸性質發生改變，但關于這種變異如何影響NOD1基因功能未有報道。

吸煙是導致肺癌發病的高風險環境因素。本研究病例組中44.8%的患者為吸煙者，而對照組中僅有28.3%為吸煙者，差異具有統計學意義，證實了吸煙因素增加肺癌發病風險。有研究顯示吸煙會直接影響NOD1信號通路[18]，我們進一步對NOD1 rs2075819A>G和NOD1 rs2075820G>A進行吸煙分層分析，結果顯示rs2075819A>G遺傳變異與肺癌易感性相關只發生在不吸煙者中。

本研究同Ozbayer等[12]的研究均表明NOD1基因多態性與肺癌發病相關，證實了先天性免疫受體在腫瘤發生發展中的重要作用，提示包括NOD1受體在內的先天性免疫受體作為肺癌治療靶點的潛能。然而，本研究對NOD1多態位點的功能學機制未做深入研究，同時所研究的多態位點較少，因此還需要更多的多態位點在更大的樣本量中進一步研究。

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