FOXQ1-siRNA對甲狀腺乳頭癌TPC-1細(xì)胞侵襲遷移的影響及其機(jī)制

鐘燁，楊光華，肖童，王曉濤，田煒，張國志

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山 063000；2華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)

近年來，甲狀腺癌發(fā)病率逐年增加，其中最常見的病理類型是甲狀腺乳頭狀癌(PTC)[1]。目前PTC的治療主要采用手術(shù)切除治療和放射性131I治療，雖治療效果尚可，但是有一定的復(fù)發(fā)率[1～3]。盡管PTC預(yù)后良好且惡性程度低，但仍然有10%PTC具有侵襲性，部分患者采用常規(guī)的治療方法達(dá)不到理想效果[3]。因此近幾年來生物學(xué)治療成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，已經(jīng)鑒定出多種癌基因參與人PTC的發(fā)生[4,5]。叉頭框(FOX)基因家族功能龐大，最早在1989年由Weigel等[6]研究證實(shí)，這種轉(zhuǎn)錄因子從酵母到人類都廣泛存在。作為FOX蛋白家族的重要成員， FOXQ1是一種可以調(diào)控細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，它與腫瘤的發(fā)病機(jī)制顯著相關(guān)[7]。近年研究表明FOXQ1作為一種廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，可以激活多條信號通路從而參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及細(xì)胞增殖等生物學(xué)功能[7, 8]。2017年8～12月，本研究通過siRNA沉默人TPC-1細(xì)胞中FOXQ1基因的表達(dá)，探討FOXQ1-siRNA對于TPC-1細(xì)胞侵襲遷移的影響及其可能的機(jī)制,為PTC的基因靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 TPC-1細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心贈予，用含10%胎牛血清(FBS)、1%青鏈霉素混合液的DMEM(高糖)培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2細(xì)胞孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基和FBS均購于Gibco公司，F(xiàn)OXQ1-siRNA、無義序列RNA購于蘇州吉瑪基因有限公司，RNA提取試劑盒購于日本TaKaRa公司、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京GenStar公司，SYBR Green qPCR Master Mix、FOXQ1引物及LipofectamineTM2000均購于美國 Invitrogen公司，兔抗人FOXQ1多克隆抗體購于英國Abcam公司，兔抗人MMP7、MMP9、AKT及p-AKT(Ser473)均購于美國CST公司，HR標(biāo)記的山羊抗兔二抗、GAPDH抗體、Western相關(guān)試劑盒均購于上海碧云天公司，24孔Transwell小室購于美國Corning公司；Matrigel購于北京索萊寶科技有限公司。倒置高分辨率熒光顯微鏡購于日本OLYMPUS公司，qRT-PCR儀器購于中國香港Gene Company Iimited公司。

1.2 FOXQ1-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的干擾效果評估 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，然后將TPC-1細(xì)胞消化制備成單個的細(xì)胞懸液，將密度調(diào)整為3×105/mL后取出細(xì)胞懸液1 mL接種于六孔板中，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)融合率達(dá)到70%時隨機(jī)將細(xì)胞分為空白組、無義序列組及實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行轉(zhuǎn)染；空白組中加入等量的磷酸鹽緩沖液，無義序列組中加入LipofectamineTM2000和帶有熒光標(biāo)記的NC-siRNA(sense 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ ，antisense 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)，實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000及帶有熒光標(biāo)記的FOXQ1-siRNA(sense 5′-GCACGCAGCAAGCC-AUAUATT-3′，antisense 5′-UAUAUGGCUUGCUGCG-UGCTT-3′)，在同樣的條件下轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞。每組設(shè)置3個復(fù)孔。6 h后換液，分別在24、48、72 h利用熒光倒置顯微鏡觀察熒光蛋白表達(dá)情況，當(dāng)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%以上，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)用于qRT-PCR、Western blotting進(jìn)一步檢測FOXQ1-siRNA的干擾效率。

1.3 細(xì)胞FOXQ1基因mRNA相對表達(dá)量的檢測 采用qRT-PCR法。轉(zhuǎn)染48 h后，按TRIpure 說明書提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。FOXQ1的上下游引物序列分別為5′-ATTTCTTGCTATTGACCGATGC-3′和5′-CCCAAGGAGACCACAGTTAGAG-3′。內(nèi)參GAPDH上下游引物序列分別為5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′和5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3′。PCR擴(kuò)增的條件: 預(yù)變性95 ℃、30 s，95 ℃、5 s， 60 ℃、30 s，延伸72 ℃、40 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，各組的FOXQ1的CT值均經(jīng)過GAPDH校正后，采用2-ΔΔCT法計(jì)算FOXQ1 mRNA相對表達(dá)量。每組設(shè)置3個復(fù)孔，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)3次。

1.4 細(xì)胞FOXQ1、p-AKT、MMP7、MMP9蛋白相對表達(dá)量的檢測 采用Western blotting法。成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，提取各組細(xì)胞總蛋白，將蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑按100∶1混勻后提取各組TPC-1細(xì)胞中總蛋白，BCA法蛋白定量，蛋白變性后按照每個泳道蛋白量30 μg上樣，7.5%SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜。脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗FOXQ1(1∶500)、AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、MMP7(1∶2 000)、MMP9(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)。4 ℃搖床過夜后，0.1%TBST洗膜3次，HR標(biāo)記二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，0.1% TBST洗膜3次，ECL熒光顯色，用AI600化學(xué)發(fā)光成像儀(美國GE公司)成像。采用Image J軟件分析各組條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力的檢測 采用Transwell小室試驗(yàn)。細(xì)胞的遷移能力：轉(zhuǎn)染24 h后，將TPC-1細(xì)胞用0.25% 胰酶消化后用不含雙抗的培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液200 μL(2×105/mL)均勻接種于Transwell小室的上室內(nèi)，在下室中每孔分別加入10% FBS DMEM培養(yǎng)基600 μL。48 h后，將放置于37 ℃細(xì)胞孵箱中的24孔Transwell小室取出。清除上室內(nèi)未穿膜的細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，然后將黏附在下室面的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，蘇木素染色。在100倍的倒置顯微鏡下，每組隨機(jī)選取5個視野，計(jì)算各組穿膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組細(xì)胞的平均值。細(xì)胞的侵襲能力：首先制備Transwell小室，按照1∶3的比例將提前預(yù)冷的不含血清DMEM與Matrigel稀釋后，取稀釋液40 μL均勻滴加在Transwell小室的上室面，放置于37 ℃恒溫孵育箱過夜，次日紫外線燈下照射30 min。依照24孔小室檢測細(xì)胞的遷移試驗(yàn)進(jìn)行其余的步驟。顯微鏡下每組隨機(jī)挑選5個視野，計(jì)算穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)，分析侵襲能力的變化。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 FOXQ1-siRNA轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞的干擾效果 無義序列組和實(shí)驗(yàn)組的siRNA轉(zhuǎn)染到TPC-1細(xì)胞有綠色熒光蛋白的表達(dá)，在48 h時細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)80%以上。

2.2 各組TPC-1細(xì)胞中FOXQ1 mRNA及蛋白的表達(dá)比較 空白組、無義序列組、實(shí)驗(yàn)組FOXQ1 mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、0.93±0.04、0.23±0.47；與空白組和無義序列組相比，實(shí)驗(yàn)組FOXQ1 mRNA表達(dá)量降低(P均<0.05)；空白組和無義序列組比較，P>0.05。空白組、無義序列組、實(shí)驗(yàn)組FOXQ1蛋白的相對表達(dá)量分別為1.52±0.19、1.48±0.22、0.32±0.03。實(shí)驗(yàn)組FOXQ1蛋白表達(dá)量較空白組和無義序列組降低(P均<0.05)，空白組與無義序列組比較，P>0.05。

2.3 各組TPC-1細(xì)胞中p-AKT、MMP7、MMP9蛋白的表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)組TPC-1細(xì)胞中p-AKT、MMP7、MMP9蛋白的相對表達(dá)量低于空白組和無義序列組(P均<0.05),空白組與無義序列組比較，P均>0.05。見表1。

表1 各組TPC-1細(xì)胞中p-AKT、MMP7、MMP9蛋白的相對表達(dá)量比較

2.4 各組TPC-1細(xì)胞侵襲、遷移能力比較 遷移試驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組中穿過Transwell小室膜的TPC-1細(xì)胞數(shù)[(19.38±3.86)個/Hp]少于空白組[(68.23±7.38)個/Hp]和無義序列組[(65.12±6.36)個/Hp](P均<0.05)；侵襲試驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組中穿過Transwell小室膜的TPC-1細(xì)胞數(shù)[(15.58±4.89)個/Hp]低于空白組[(48.62±6.28)個/Hp]和無義序列組[(45.38±5.63)個/Hp](P均<0.05)。

3 討論

甲狀腺癌是最常見內(nèi)分泌腫瘤之一，目前已經(jīng)成為女性第五位常見的腫瘤[9]。在甲狀腺癌中，PTC約占80%，好發(fā)于女性和兒童，早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，這是影響PTC患者預(yù)后及復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素[10]。因此對于PTC侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制的研究尤為重要。近年研究表明，轉(zhuǎn)錄因子FOXQ1參與多種腫瘤的生物學(xué)行為過程[11]。FOXQ1異常表達(dá)與腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能是預(yù)測腫瘤疾病預(yù)后的關(guān)鍵性因子[12,13]。研究證實(shí)，F(xiàn)OXQ1在結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌等腫瘤中出現(xiàn)異常表達(dá)，其表達(dá)水平明顯高于其癌旁正常組織，這種異常表達(dá)與腫瘤浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，可能通過調(diào)控血管形成和抗凋亡作用導(dǎo)致腫瘤生長[14～16]。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXQ1在PTC組織中也異常高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)，它可能是調(diào)控PTC發(fā)生及發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子。這些研究提示FOXQ1有可能是PTC分子生物治療靶點(diǎn)的重要基因。siRNA是一種阻斷特定基因的技術(shù)，具有高度的序列特異性，可以特異性地抑制RNA序列，從而極高效率地阻斷目的蛋白的表達(dá)水平。本研究通過FOXQ1-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%以上，實(shí)驗(yàn)組中FOXQ1 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量低于空白組和無義序列組。

研究表明，在PTC中PI3K/AKT信號通路異常改變，其參與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性的調(diào)節(jié)，與腫瘤浸潤程度及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移存在密切聯(lián)系。MMPs在多種腫瘤中過表達(dá)，是腫瘤的惡性程度及侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)蛋白。在PTC中MMP7、MMP9均存在高表達(dá)，且MMP7蛋白表達(dá)水平與腫瘤的大小及淋巴結(jié)的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)；而MMP9的表達(dá)量與PTC腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與腫瘤的大小無關(guān)。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)促進(jìn)癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移，敲低FOXQ1在形態(tài)學(xué)和分子水平上阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的EMT,從而抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。因此我們進(jìn)一步探討FOXQ1沉默對TPC-1細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其可能的相關(guān)機(jī)制。本研究通過FOXQ1-siRNA沉默TPC-1細(xì)胞中FOXQ1基因后，體外侵襲遷移試驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞的侵襲遷移能力低于空白組和無義序列組，說明FOXQ1是PTC侵襲轉(zhuǎn)遷能力的重要調(diào)控因子。與Zhu等[16]在膀胱癌中siRNA靶向沉默F(xiàn)OXQ1可以通過逆轉(zhuǎn)EMT抑制細(xì)胞侵襲遷移能力的研究結(jié)果相一致。進(jìn)一步探討沉默TPC-1細(xì)胞FOXQ1基因后抑制侵襲轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)機(jī)制，本研究結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組中PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵因子p-AKT，以及與腫瘤的浸潤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的MMP7、MMP9蛋白的相對表達(dá)量低于空白組和無義序列組，提示FOXQ1基因可能是通過PI3K/AKT通路影響MMPs表達(dá)，從而對PTC的侵襲轉(zhuǎn)移能力進(jìn)行調(diào)控。

總之，本研究表明FOXQ1-siRAN轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞可以有效地沉默F(xiàn)OXQ1的表達(dá)，并且FOXQ1基因可能通過PI3K/AKT信號通路抑制TPC-1細(xì)胞侵襲遷移能力，F(xiàn)OXQ1基因有可能成為PTC患者生物學(xué)治療及預(yù)后的一個新靶標(biāo)。但是FOXQ1在PTC中與腫瘤的微循環(huán)、細(xì)胞增殖的關(guān)系及相關(guān)細(xì)胞信號通路的調(diào)控機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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