熒光定量PCR技術(shù)在食品包裝材料致病菌監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

雷 瓊

(貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州 貴陽(yáng) 550016)

現(xiàn)今，食品安全問(wèn)題在我國(guó)矛盾突出，食品問(wèn)題層出不窮，嚴(yán)重影響國(guó)民的生活健康。為了進(jìn)一步加強(qiáng)食品安全，找出影響食品安全的因素成為解決問(wèn)題的關(guān)鍵。食品包裝作為食品的外衣，污染物可通過(guò)擴(kuò)散、溶解和分散進(jìn)入到食品，食品包裝已成為影響食品安全性的主要因素[1]。在我國(guó)食品安全突出的大環(huán)境下，建立一種快速安全的食品包裝材檢測(cè)方法至關(guān)重要。食品包裝材料的安全性檢測(cè)主要是通過(guò)化學(xué)物理等方法進(jìn)行如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、頂空氣相色和高效液相色譜-質(zhì)譜連用(HPLC-MS)等[2]。采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行包裝材料致病菌檢測(cè)就所查文獻(xiàn)，尚未報(bào)到。

實(shí)時(shí)熒光PCR(Quantitative Real-time PCR)是在PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種新型核酸定量技術(shù)，可進(jìn)一步將熒光能量傳遞技術(shù)應(yīng)用于常規(guī)的PCR 儀器中，現(xiàn)已成為微生物學(xué)診斷最強(qiáng)有力的工具[3]。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA模板的定量，還具有高靈敏度、高特異性和高可靠性等優(yōu)點(diǎn)。雷永良等在2009年將Real-time PCR技術(shù)運(yùn)用于食品污染物監(jiān)測(cè)中，并采用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明熒光PCR方法較傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法具有更高的特異性和準(zhǔn)確性[4]。周麗民等在2009 年至 2010 年將實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)應(yīng)用于臨床快速篩查致病菌，認(rèn)為該法是快速篩查致病菌的理想檢測(cè)方法[5]。高濤等于2017年將免疫磁珠富集-實(shí)時(shí)熒PCR技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌 3 種致病菌，建立食品微生物及其致病因子的監(jiān)測(cè)新技術(shù)[6]。張靖雯在2017年報(bào)道，熒光定量 PCR 技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外的環(huán)境監(jiān)測(cè)方面，有助于環(huán)境中微生物的檢測(cè)及研究[7]。目前，熒光定量PCR已廣泛應(yīng)用于食品、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及環(huán)境等多研究等領(lǐng)域，但尚未應(yīng)用于食品包裝材料安全性檢測(cè)中。

面對(duì)國(guó)內(nèi)食品安全事件日益嚴(yán)峻，備受重點(diǎn)關(guān)注的現(xiàn)狀，為了進(jìn)一步保護(hù)消費(fèi)者的切身利益，將熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于食品包裝材料中致病菌的檢測(cè)，建立一種新型快速簡(jiǎn)便的高效檢測(cè)方法，從分子生物學(xué)角度為食品安全性檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料：食品包裝材料(空白及添加陽(yáng)性菌)；試劑：基因組提取試劑盒(TaKaRa，9763)；熒光定量試劑盒(深圳生科源)；瓊脂糖(Agarose)、無(wú)水乙醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等試劑均為國(guó)產(chǎn)。

儀器：移液器量程覆蓋0.1～100μL共5 支(Eppendorf)；C1000TM Thermal Cycler PCR儀；Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；2-16k高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)； DYY-4型電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組提取

稱取樣品5.0 g與450 mLPBS緩沖液中，按照基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA，加入0.7%瓊脂糖凝膠電泳30min，利用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)DNA純度及完整度，核酸測(cè)定儀檢測(cè)質(zhì)量和濃度。

1.2.2 熒光定量PCR檢測(cè)體系

表1 熒光定量PCR反應(yīng)體系

根據(jù)熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)反應(yīng)體系為2×SYBR Primex Ex Taq 12.5μL、PCR forward primer 1μL、PCR Reverse primer 1μL、DNA模板2μL、ddH2O 8.5μL。反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 基因組提取結(jié)果圖

圖1 細(xì)菌基因組

由圖1可知，細(xì)菌基因組DNA提取結(jié)果正確，條帶單一且明亮整齊，無(wú)降解。點(diǎn)樣孔沒(méi)有亮點(diǎn)，表明提取的基因組DNA純度較高，沒(méi)有蛋白質(zhì)和RNA污染。核酸測(cè)定儀結(jié)果顯示，OD260/OD280為1.82及1.80，滿足PCR反應(yīng)要求。

2.2 熒光定量PCR結(jié)果圖

構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖2可知擴(kuò)增效率為101.5%，R2為0.99。溶解峰峰型單一，無(wú)雜峰，說(shuō)明無(wú)非特異性擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)曲線及溶解峰結(jié)果均滿足熒光定量PCR要求，數(shù)據(jù)可信。

圖2 溶解曲線及溶解峰

熒光定量PCR結(jié)果見(jiàn)圖3，5～8常規(guī)樣品，其擴(kuò)增曲線為直線，無(wú)Ct值，無(wú)擴(kuò)增效率，表明沒(méi)有致病菌存在；1～4號(hào)添加標(biāo)準(zhǔn)菌株的樣品，其Ct≤35，出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)判定結(jié)果為陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完全一致。

圖3 熒光定量PCR結(jié)果圖

3 結(jié)果與分析

試驗(yàn)表明，實(shí)時(shí)熒光PCR 測(cè)定食品包裝材料中致病菌的結(jié)果為陽(yáng)性，與預(yù)期結(jié)果一致。證明熒光定量PCR技術(shù)可用于食品包裝材料致病菌檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本方法具有準(zhǔn)確度高、過(guò)程簡(jiǎn)單安全、節(jié)省人力及實(shí)驗(yàn)耗材、重復(fù)性好等特點(diǎn)，能夠快速高效地測(cè)定批量的樣品。

近年來(lái)，食品安全事件頻發(fā)，目前檢測(cè)病原細(xì)菌的方法主要是細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法，要經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)、生理生化鑒定、形態(tài)觀察等。趙琢等在2013年采用多重PCR的方法對(duì)食品包裝材料中對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)，取得了較為滿意的檢測(cè)靈敏度[8]。本研究建立的熒光定量PCR 方法可完成對(duì)多種致病菌的檢測(cè)，與傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法及普通PCR技術(shù)相比較，步驟簡(jiǎn)單，具有更高的特異性和靈敏度，更加簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，具有更高的應(yīng)用價(jià)值，為食品包裝材料中致病菌檢測(cè)提供了一種分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)于提升食源性致病菌的綜合檢測(cè)能力，滿足國(guó)家食品包裝及食品檢驗(yàn)中心的建設(shè)需求具有重要意義，為今后食品包裝材料的安全性檢測(cè)科研數(shù)據(jù)等奠定基礎(chǔ)[9]。

參考文獻(xiàn)

[1]唐 玉,張峻嶺.食品包裝安全分析[J].食品界,2016(6):26-27.

[2]秦 蓓.塑料食品包裝材料安全性研究現(xiàn)狀[J].包裝工程,2011(19):33-37.

[3] Sachse K.Specificity and performance of diagnostic PCR assays[J].Methods in Molecular Biology,2003,216(216):3-29.

[4]雷永良,王曉光,葉碧峰,等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食品污染物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2009(4):828-830.

[5]周麗民,雷永良,王小光,等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用[J].標(biāo)記免疫分析與臨床,2012,19(5):296-299.

[6]高 濤,張麗萍,魏 雯,等.免疫磁珠富集-實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在食源性致病菌監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用研究[J].醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制,2017(1):18-20.

[7]張靖雯.熒光定量PCR技術(shù)在環(huán)境微生物檢測(cè)中的應(yīng)用研究[J].智庫(kù)時(shí)代,2017(5):43-45.

[8]趙 琢,栗建永,賈曉川,等.食品接觸材料中沙門氏菌的多重PCR檢測(cè)方法[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2013(24):193-196.

[9]左澤彥,孫端方.實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)食品中牛及豬源性成分[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(4):130-132.