附子不同炮制品對麻黃細辛附子湯指紋圖譜的影響研究

孫 紅，韓 旭，王冠杰，邱麗麗，李 燦，容 蓉

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355 )

麻黃細辛附子湯具有悠久歷史，張仲景在傷寒論中寫道“少陰病，反發(fā)熱，脈沉者，麻黃細辛附子湯主之?！庇纱丝梢姡摲街饕糜谥委燇w質(zhì)陽虛，外感風(fēng)寒者，可溫經(jīng)解表。方中藥材正如其名，以麻黃為君藥，加以臣藥附子佐藥細辛配伍，具有宣上溫下開竅啟閉之功。現(xiàn)代臨床多用于抗炎，抑制哮喘病發(fā)作，免疫調(diào)節(jié)[1]等。本方由麻黃(HerbaEphedrae)，細辛(RadixEtRhizomaAsari)附子(RadixAconitiLateralisPraeparata)三味中藥組成[2]。其中附子有不同炮制規(guī)格且因地而異，因此使用不同炮制規(guī)格的附子對制成的麻黃附子細辛湯制劑的質(zhì)量控制研究具有重要意義，因此研究不同炮制規(guī)格附子對麻辛附湯溶出度的影響具有重大意義。本文運用高效液相色譜制作分別含有白附片，淡附片，黑順片，炮附子四種附子麻黃附子細辛湯的指紋圖譜，以炮附子指紋圖譜為參照圖譜，通過指紋圖譜的對比分析，進一步研究不同炮制規(guī)格的附子對麻黃附子細辛湯的質(zhì)量影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀；十萬分之一電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；臺式高速離心機(TGL-16G,上海醫(yī)用分析儀器廠)；電熱恒溫水文箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 試藥

麻黃為麻黃科植物草麻黃( Ephedra sinica Stapf．)的干燥草質(zhì)莖(產(chǎn)地內(nèi)蒙古)，炮附子、黑順片、淡附片、白附片為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaeli Debx．)子根的加工品(產(chǎn)地四川)，細辛為馬兜鈴科植物北細辛(Asarum heterotropoldes Fr．Schmidt var．Mandshuricum ( Maxim．) Kitag．)的干燥根及根莖(產(chǎn)地吉林)，以上藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定，均符合《中國藥典》2015 年版標準。甲醇(色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，水(娃哈哈純凈水)，磷酸(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 麻黃細辛附子湯指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18(4.6×250 mm,5μm，美國安捷倫公司)；流動相：甲醇(A)-0.2%磷酸水溶液(B)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL；采用梯度洗脫，梯度變化條件見表1。

表1 HPLC梯度變化條件

2.1.2 麻黃細辛附子湯的制備

分別取炮附子、黑順片、淡附片、白附片按傳統(tǒng)處方比例麻黃∶細辛∶附子=2∶1∶3[3]，即取麻黃6 g，細辛3 g，附子9 g，用水浸泡30min，加16倍水回流提取兩次，每次1 h，提取液水浴濃縮，濃縮液離心15min(4000 r/min)，定容至50 mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 供試品溶液的制備

分別取炮附子、黑順片、淡附片、白附片的樣品液各3mL，加無水乙醇定容至10 mL，靜置過夜。過濾，取續(xù)濾液5 mL于蒸發(fā)皿中，水浴濃縮至干，加蒸餾水溶解，分別轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，定容至刻度，得供試品溶液。

2.1.4 麻黃細辛附子湯指紋圖譜

分別吸取2.1.3項下炮附子、黑順片、淡附片、白附片的供試品溶液，以2.1.1項下的色譜條件進樣，記錄4種附子炮制品的HPLC指紋圖譜。將所得的指紋圖譜以AIA的形式保存，導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2004A 版)，分析處理后共得到7個共有指紋峰。結(jié)果如圖1。

S1-白附片；S2-淡附片；S3-黑順片；S4-炮附子

圖1 附子不同炮制品麻黃細辛附子湯指紋圖譜

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 精密度試驗

取同一份供試品溶液以2.1.1項下的色譜條件，在一定時間內(nèi)連續(xù)進樣五次，記錄下它們的指紋圖譜。采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2004A 版)對指紋圖譜中7個共有指紋峰的相對保留時間和相對保留峰面積進行計算，相對保留時間的RSD%范圍在0.005%～0.089%，相對保留峰面積的RSD%范圍在1.024%～2.072%。表明儀器的精密性良好。具體數(shù)值見表2。

2.1.5.2 重現(xiàn)性實驗

取同一供試品溶液5份以2.1.1項下的色譜條件進樣，記錄下它們的指紋圖譜。將所得的指紋圖譜的數(shù)據(jù)采用2.1.5項下(1)中的軟件對指紋圖譜中7個共有指紋峰的相對保留時間和相對保留峰面積進行計算，相對保留時間的RSD%范圍在0.012%～0.093%，相對保留峰面積的RSD%范圍在1.022%～1.912%。表明實驗的重現(xiàn)性良好。具體數(shù)值見表2。。

2.1.5.3 穩(wěn)定性實驗

取同一供試品溶液分別在放置0,2,4,8,12,24 h后以2.1.1項下的色譜條件進樣，記錄下它們的指紋圖譜。將所得的指紋圖譜的數(shù)據(jù)采用2.1.5項下(1)中的軟件對指紋圖譜中7個共有指紋峰的相對保留時間和相對保留峰面積進行計算，相對保留時間的RSD%范圍在0.057%～0.163%，相對保留峰面積的RSD%范圍在1.254%～2.192%。表明實驗的穩(wěn)定性良好。具體數(shù)值見表2。

表2 方法學(xué)考察中各主要峰的相對保留時間(Rt)和相對保留面積(Ra)

2.2 附子不同炮制品對麻黃細辛附子湯指紋圖譜的影響

2.2.1 指紋圖譜的相似度計算

表3 附子不同炮制品相似度計算結(jié)果

將4種附子炮制品的麻黃細辛附子湯指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2004 A版)，參照圖譜使用炮附子的麻黃細辛附子湯的指紋圖譜，對附子不同炮制品的麻黃細辛附子湯指紋圖譜進行相似度分析，對7個共有指紋峰進行匹配，再通過平均數(shù)計算的方法，進一步得出附子不同炮制品麻黃細辛附子湯指紋圖譜的共有模式，并以次為規(guī)范，進行相似度的整體評價。相似度計算結(jié)果見表3。

從表3可以看出，附子不同炮制品的麻黃細辛附子湯指紋圖譜相似度均大于0.90，說明附子不同炮制品的麻黃細辛附子湯色譜模式相似，其化學(xué)成分一致性較好。但仍存在差異，三種炮制附子與炮附子麻黃細辛附子湯指紋圖譜相似度相比有明顯差別，同時不同炮制品之間的相似度也存在差異。其中，白附片與炮附子的相似度最高，達到98.3%，淡附片與炮附子的相似度最低，為90.5%。

2.2.2 附子不同炮制品對麻黃細辛附子湯指紋圖譜的影響分析

在共有指紋峰中，以4號峰為參照峰，計算各峰的相對保留峰面積，用炮附子的麻黃細辛附子湯指紋圖譜為參照圖譜。結(jié)果見表4。

表4 附子不同炮制品的相對峰面積

分析結(jié)果表明，附子不同炮制品對麻黃細辛附子湯指紋圖譜的影響具有一定的差異性。以臨床常用的炮附子指紋圖譜為參照圖譜，其中，白附片、淡附片、黑順片麻黃細辛附子湯指紋圖譜的2、3號峰面積均稍小于炮附子，5、7號峰面積均顯著大于炮附子；而在1號峰峰面積比較中，白附片及黑順片峰面積都小于炮附子，僅淡附片峰面積大于炮附子；在6號峰峰面積比較中，淡附片及黑順片峰面積都大于炮附子，且淡附片峰面積顯著增大，而白附片峰面積小于炮附子。

3 討論

中藥指紋圖譜可整體地反映出復(fù)方中各化學(xué)成分的變化狀況，從而進一步反映出各種藥材之間的相互作用關(guān)系。在中藥材質(zhì)量評價方面的作用和地位得到了社會廣泛的認可。

本研究以炮附子麻黃細辛附子湯指紋圖譜為參照圖譜，研究白附片、淡附片、黑順片對麻黃細辛附子湯指紋圖譜的影響。通過相似度計算可知，白順片與炮附子指紋圖譜最為相似，化學(xué)成分較相似，則其麻黃細辛附子湯臨床藥效也將最為相近。而淡附片、黑順片與炮附子相似度則較差，說明二者炮制方法較大地改變了化學(xué)成分。

附子不同炮制品的麻黃細辛附子湯指紋圖譜存在較多數(shù)共有指紋峰，且大多數(shù)共有指紋峰的峰面積比較大，說明附子不同炮制品對麻黃細辛附子湯化學(xué)成分的影響處在較穩(wěn)定的范圍，這為麻黃細辛附子湯不同炮制品的臨床應(yīng)用的療效奠定了一定的基礎(chǔ)。而藥材經(jīng)過炮制造成麻黃細辛附子湯化學(xué)成分之間有所差異，因此表現(xiàn)在圖譜上是同一保留時間上的峰面積不同，進而表現(xiàn)出臨床療效將有所差別。本實驗發(fā)現(xiàn)附子不同炮制品麻黃細辛附子湯指紋圖譜存在差異，與炮附子相比，白附片、淡附片、黑順片的共有峰峰面積均發(fā)生變化，這些共有峰是哪一種成分未知，為進一步的研究提供了依據(jù)。

參考文獻

[1]王艷宏,包 蕾,劉振強,等. 麻黃附子細辛湯藥理作用研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2010,21(1):216-217.

[2]張俊斐,趙浩如. RP-HPLC法測定麻黃附子細辛湯水煎液中麻黃堿的含量[J]. 海峽藥學(xué),2009,21(3):41-43.

[3]王小平.麻黃細辛附子湯抗病毒活性部位及其血清指紋圖譜研究[D].濟南：山東中醫(yī)藥大學(xué),2010:46.