GC-MS法測定甲磺酸萘莫司他中的甲磺酸甲酯與甲磺酸乙酯

曹 衛，郭彥飛，黃志勇

(南京海融醫藥科技股份有限公司，江蘇 南京 211100)

甲磺酸萘莫司他(NafamostatMesilate)，化學名為對-胍基苯甲酸6-脒基-2-萘酯二甲磺酸鹽，適用于急性胰腺炎、慢性胰腺炎的急性惡化、手術后急性胰腺炎、胰管造影后的急性胰腺炎與外傷性胰腺炎急性炎癥的改善，由日本鳥居藥品株式會社研發并于1986年在日本首次上市[1]。目前該藥國內未上市，尚處于仿制申報階段。

甲磺酸萘莫司他為甲磺酸鹽，合成過程中使用了甲醇和乙醇[2]，甲醇和乙醇易和甲磺酸鹽生成具有遺傳毒性的甲磺酸甲酯(MMS)和甲磺酸乙酯(EMS)這兩種雜質。一些甲磺酸酯的臨床前研究發現這些甲磺酸酯可直接與生物大分子(DNAs，RNAs和蛋白質)發生烷基化反應，可能會導致DNA突變，致癌效應和致畸效應[3]。近年來，歐洲藥物管理局(EMEA)和美國食品藥品監督管理局(FDA)陸續發布了遺傳毒性雜質控制的相關法規，提出了采用“毒理學關注閾值”(Threshold of Toxicological Concern，TTC)[4-5]，具體含義為：一個“1.5μg/d”的TTC值，即相當于每天攝入1.5μg的基因毒性雜質，被認為對于大多數藥品來說是可以接受的風險(一生中致癌的風險小于十萬分之一)，按照這個閥值，可以根據預期的每日攝入量計算出活性藥物中可接受的雜質水平。

因甲磺酸酯類的雜質限度要求較低，通常的色譜分析方法會面臨檢測靈敏度不夠、樣品基質干擾以及樣品中的甲磺酸與醇類流動相反應生成磺酸酯干擾測定等問題，故本次實驗筆者參考《歐洲藥典》EP9.0中關于甲磺酸鹽中對甲磺酸甲酯、乙酯的測定方法(2.5.37.Methy，Ethyl and Isopropyl Methanesulfonate in Methanesulfonic Acid[6])，采用二氯甲烷萃取技術與GC-MS聯用，對上述兩種物質進行研究。

1 儀器與試藥

GC-MS2010plus氣質聯用色譜儀，日本Shimadzu公司；BT125D分析天平，德國賽多利斯公司；HP-5毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm)，美國安捷倫公司；甲磺酸甲酯(批號：LS20P45，純度99%)，甲磺酸乙酯(批號：L680O91，純度98.5%)，甲磺酸異丙酯(批號：LC30P16，純度97%)，北京百靈威科技有限公司；色譜級二氯甲烷；分析級無水硫酸鈉；甲磺酸萘莫司他原料(批號：170401、170402、170403)，南京海融醫藥科技股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

內標溶液：稱取甲磺酸異丙酯約12.5 mg，置50 mL量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，取該溶液1.0 mL，置100 mL量瓶中，二氯甲烷稀釋至刻度(2.5μg/mL)，取該溶液10.0 mL，置100 mL量瓶中，二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：精密稱取樣品0.2 g，加2 mL水溶解后，加2 mL內標溶液提取，分離和轉移有機層至約含0.2g無水硫酸鈉的小瓶中，過濾，取續濾液，即得。

對照品溶液：精密稱取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯各約12.5 mg，分別置50 mL量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度(250μg/mL)，取該溶液1.0 mL，分別置100 mL量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度(2.5μg/mL)，分別取上述兩溶液1.0 mL和濃度為2.5μg/mL的內標溶液1.0 mL，置同一10 mL量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

定位溶液：分別取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯濃度均為2.5μg/mL的溶液各1 mL，分別置10 mL量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，作為定位溶液。

2.2 色譜條件

色譜條件：載氣為高純氦氣；柱流量：1.5 mL/min；分流比為2∶1；進樣量1μL；采用程序升溫，起始柱溫45℃，保持1min，再以10℃/min，升到135℃，維持2min；進樣口溫度為240℃。

質譜條件：離子源溫度為230℃；接口溫度為260℃；溶劑延遲時間：2.5min；檢測器電壓：調諧電壓；電子能量：70eV；掃描(檢測)方式：選擇性離子檢測(SIM)。甲磺酸甲酯、乙酯、異丙酯m/z的為80、79和123。

2.3 系統適用性試驗

分別取空白溶液(二氯甲烷)和“2.1”項下的對照品溶液各1.0μL注入氣質聯用色譜儀，按“2.2”項下的GC-MS條件進行檢測，記錄色譜圖，結果各雜質峰分離均大于1.5，空白溶劑不干擾測定。對照品色譜圖見圖1。

圖1 對照品溶液色譜圖

2.4 線性試驗

精密稱取甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯各適量，加二氯甲烷溶解并稀釋制成每1mL中各約含0.5μg/mL的溶液，作為混合對照品溶液；精密量取混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、3.0、5、8mL分別置10mL量瓶中，各加濃度為2.5μg/mL內標溶液1mL后，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，制得濃度分別為0.01、0.025、0.05、0.15、0.25、0.4μg/mL的溶液，作為線性考察溶液(1)～(6)；取溶液(1)～(6)，按“2.2”項下的GC-MS條件進行檢測，記錄色譜圖。以各成分的濃度為橫坐標，雜質峰面積與內標峰面積比為縱坐標進行線性回歸，得甲磺酸甲酯的回歸方程為y=3.4022x-0.0065(r=0.9999)，甲磺酸乙酯的回歸方程為y=3.2865x+0.0025(r=0.9999)。結果表明，甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯在0.01～0.4μg/mL的濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取“2.4”項下的線性考察溶液(5)1.0μL，照“2.2”項下的GC-MS條件，連續進樣5次，記錄峰面積，結果，甲磺酸甲酯峰與甲磺酸異丙酯(內標)峰面積比的RSD為1.3%，甲磺酸乙酯峰與甲磺酸異丙酯(內標)峰面積比的RSD為3.7%，表明儀器精密度良好。

2.6 檢測限與定量限試驗

根據標準曲線最低濃度峰的信號，取“2.1”項下各定位溶液，用二氯甲烷逐級稀釋后，照“2.2”項下的GC-MS條件進樣檢測，測得各雜質的檢測限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10)。結果，甲磺酸甲酯與甲磺酸乙酯的檢測限分別為5 ng/mL和3ng/mL，定量限分別為14.8ng/mL和7.5ng/mL。

2.7 重復性試驗

取原料(批號170401)0.2g，精密稱定，按“2.1”項下供試品溶液配置方法進行配制，共配制6份，照“2.2”項下的GC-MS條件進樣檢測，記錄色譜圖，結果，樣品中均未檢測出甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯。

2.8 加樣回收試驗

取濃度為25μg/mL的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯溶液各0.8mL置同一100mL量瓶中，加入25μg/mL的內標溶液1.0mL，在室溫下揮去二氯甲烷后，用水溶解并稀釋至刻度，得80%回收率儲備液；另同法制備100%和120%的回收率儲備液。取原料(批號170401)0.2g，9份，精密稱定，分別加入80%、100%、120%回收率貯備液各2 mL(各三份)，超聲使溶解，加2 mL二氯甲烷萃取，取下層有機相，各加入約0.2g的無水硫酸鈉，過濾，取續濾液作為供試品溶液，照“2.2”項下的GC-MS條件進樣檢測，記錄色譜圖，結果，甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的平均回收率(n=3)分別為90.2%和97.0%，RSD分別為1.5%和6.1%。表明該方法回收率良好。

2.9 樣品測定

取3批原料各適量，精密稱定，按“2.1”項下供試品溶液配置方法進行配制，照“2.2”項下的GC-MS條件進樣檢測，記錄色譜圖，結果，3批樣品均未檢出甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯。

3 討論

3.1 限度的確定

甲磺酸萘莫司他的每日最大日使用量為600 mg，按TTC值為1.5μg/d，用1.5μg除以日最大劑量600 mg，即甲磺酸萘莫司中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯不得過2.5μg/g，按此限度進行方法學驗證，本試驗的限度保證了甲磺酸萘莫司他的用藥安全。

3.2 氣相色譜條件的選擇與優化

因本品配制過程中需要用到提取分離，為消除由操作條件的波動而對分析結果產生的影響，提高分析結果的準確度，固在檢測過程中加入內標物質，EP9.0中關于甲磺酸鹽中對甲磺酸甲酯、乙酯、異丙酯的測定方法中采用甲磺酸丁酯作為內標物質，因本品工藝過程中未使用異丙酯，固本次實驗將甲磺酸異丙酯作為內標物質。

由于甲磺酸萘莫司他在水中易溶，因此采用水使樣品溶解后，再用含甲磺酸異丙酯的二氯甲烷溶液將樣品中存在的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯提取出來。

圖2 二氯甲烷干擾色譜圖

參照EP9.0中關于甲磺酸鹽中對甲磺酸甲酯、乙酯、異丙酯的測定方法，升溫程序為起始柱溫55℃，保持1min，再以10℃/min，升到135℃，維持2min；進樣口溫度為240℃時，各雜質峰分離均較好，但二氯甲烷對甲磺酸乙酯有干擾，色譜圖見圖2。故在此升溫程序的基礎上微調升溫程序，最終溶劑峰不干擾雜質檢測，各峰之間分離度均大于1.5。

參考文獻

[1] 陸美貞.抗胰腺炎藥甲磺酸萘莫司他[J].國外藥學—合成藥、生化藥、制劑分冊，1988，9(4)：234-235.

[2]陳寶泉，趙煜松，歐陽杰，等.甲磺酸萘莫司他的合成[J].中國醫藥工業雜志，2007，38(8)：545.

[3] Benigni R,Bossa C.Chanisms of Chemical carcinogenicity and mutagenicity:a review with implications for predictive toxicology[J].Chem Rev，2011，111( 4) :2507-2536.

[4]EMEA.Guidelines on the limits of genotoxic impurities[S].London:EMEA,2006.

[5]FDA.Guidance for industry: Genotoxic and carcinogenicimpurities in drug substances and products: recommended approaches[S].US:FDA,2008.

[6]European Pharmacopoeia 9.0，2.5.37.Methyl，ethyl and isopropyl methanesulfonate in methanesulfonic acid[S].EDQM,2017:176-177.