一株茶園草甘膦降解菌的篩選與鑒定

賀望興 楊普香 石旭平 謝小群 朱運華 蔡翔

(江西省蠶桑茶葉研究所 330202)

草甘膦(C3H8NO5P)又稱農達(Roundup)，是一種高效、低毒、廣譜和內吸傳導、非選擇性葉面噴施的除草劑[1]。其主要存在形態為酸和以草甘膦異丙胺鹽為主的鹽類，微溶于水，不溶于一般有機溶劑，其異丙胺鹽完全溶解于水。草甘膦主要通過抑制植物體內的烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，從而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的轉化，使蛋白質合成受到干擾，導致植物死亡[2]。自1971年Monsanto公司John Franz等開發以來，草甘膦以高效廣譜低毒而被廣泛應用于農作物、林木和果園中，是全世界除草劑使用量最大的藥品[3]，然而草甘膦的大量使用對土壤、水體及生物等造成了較大的污染，同時對土壤生物化學過程產生一定影響，給環境尤其是土壤帶來污染和生態失衡，從而影響其在土壤中的生物轉化[4～5]。因此，草甘膦對人類和環境的毒性受到廣泛關注。

草甘膦在土壤中的降解是一個復雜的過程，降解的途徑和速率受到多種因素的影響[6]。據報道草甘膦在土壤中的半衰期在1～174d 的范圍內變化，其主要的降解產物為氨甲基磷酸(AMPA)[7]，其中土壤生物對草甘膦在土壤中的降解做出了主要貢獻[8]。Araújo 等[9]采用土壤呼吸方法測定土壤微生物對草甘膦降解，研究結果表明土壤中草甘膦的降解主要是由微生物作用導致的。本研究從長期施用草甘膦的茶園土壤中經過初篩、復篩篩選分離得到一株能以草甘膦為唯一碳源生長并且能夠降解草甘膦的菌株，通過該菌株16Sr DNA同源性分析，推斷該菌株為微球菌屬。

1 材料與方法

1.1 培養基

富集培養基(g/L)：蛋白胨5，酵母提取物5，磷酸氫二鉀1，葡萄糖1，pH值 7．0～7．2。

LB培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂粉15，pH 值7.0～7.2。

基礎無機鹽培養基MSM(g/L)：磷酸氫二納1.5，磷酸二氫鉀1.5，硝酸四氫氮1，硫酸鎂0.2，氯化鈣0.01，硫酸鎂0.001，酵母提取物0.05，pH 值7.0～7.2。

分離培養基：在MSM培養基中加入草甘膦，使培養基中草甘膦的終濃度達到實驗所需濃度。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試土壤的馴化

采用五點采樣法收集茶園草甘膦污染區土壤，然后將土壤按1:1:1:1:1的比例混合于實驗容器內，每天澆灌適量草甘膦稀釋液，保持土壤濕潤，第一個月澆灌的草甘膦稀釋液濃度為50mg/L，每個月以50mg/L的濃度增幅依次遞增，澆灌馴化6個月，即為馴化土樣。

1.2.2 降解菌系的富集及降解菌株的分離、純化

富集培養：取馴化土樣5g到100mL含草甘膦50mg/L的富集培養基中，30℃，170r/min震蕩培養7d。

馴化培養：吸取富集培養液10mL轉接到100mL含有100mg/L的草甘膦的MSM培養基中，30℃，170r/min震蕩培養7d。取10mL培養液接入到濃度為200mg/L草甘膦的MSM培養基中，培養方法同上，震蕩培養7d，用同樣的培養方法，以100mg/L的濃度增幅依次提高MSM培養基中草甘膦的濃度至1 000mg/L。

分離純化：將最終馴化得到的培養液經過梯度稀釋后涂布在含有100mg/L草甘膦的MSM培養基平板上，每個梯度(10-1、10-2、10-3、10-4)涂布三塊平板，30℃恒溫培養3d。挑取生長旺盛的單菌落進行反復劃線純化，將純化后的菌株保存在含有15%甘油和100mg/L草甘膦的LB培養基中，編號，于-80℃冰箱內保存備用。

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 形態學觀察

將分離純化得到的降解菌采用平板劃線法接種到固體LB培養基上，30℃培養24 h后觀察菌落形態。

1.2.3.2 革蘭氏染色

通過革蘭氏染色法觀察對數生長期的降解菌個體形態及菌落特征，細菌鑒定則依據《伯杰細菌鑒定手冊》及《常見細菌系統鑒定手冊》進行 。

1.2.4 CGL-1菌生長曲線分析

用接種環取一環經過平板活化的CGL-1菌至含100 mg/L草甘膦的MSM液體培養基中，在30℃，170r/min的條件下每隔2 h取一次菌液，菌液在600nm[10]波長下測定其光密度值(OD)，繪制CGL-1菌的生長曲線。

1.2.5 菌株耐草甘膦最高濃度

將處于對數生長期的CGL-1菌適量分別接種到草甘膦梯度分別為200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L、1 000 mg/L、1 200 mg/L、1 400 mg/L、1 600 mg/L、1 800 mg/L的MSM液體培養基中，每處理3個重復，以不加草甘膦的培養基作為對照，測定每個梯度濃度下CGL-1菌在30℃，170 r/min，培養1 d發酵液中CGL-1菌活性,確定CGL-1菌旺盛生長的最高耐草甘膦濃度。

1.2.6 CGL-1菌系統發育樹分析

1.2.6.1 菌株總DNA的提取

①取1mL菌液，8 000g，離心2min，棄上清，加400μL提取緩沖液沖洗細胞2次，8 000g，離心2 min，棄上清。

②用200μL TE buffer懸浮菌體，加入100μL的Tris 飽和酚(pH 值8.0)，渦旋混合1 min。

③13 000 g，離心5 min，取上清。

④加入40μL TE buffer和100μL氯仿，混合震蕩，13 000 g，離心5 min。

⑤取160μL上清液，加入40μL TE buffer和5μL RNase(10mg/mL)，37℃放置10 min。

1.2.6.2 菌株16S rDNA擴增

引物序列：

P0：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

P6：5’-CATCGGCTACCTTGTTACGA-3’

PCR擴增反應體系：

反應物 體積(μL)

細菌總DNA模板(約100ng/μL) 1

Taq PCR Mix 12.5μL(2x) 12.5

引物 P0(10μΜ) 1

引物 P6(10μΜ) 1

去離子水 9.5

PCR 反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸90 s，循環30次，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR產物送往上海生工生物公司測序。

1.2.6.3 菌株系統發育樹的構建

將測序結果序列提交GenBank進行BLAST比對，下載相似度大于95%的模式菌株的序列，以fasta格式整合到一個文件內，啟動MEGA 5.0軟件，將得到的整合文件導入到MEGA軟件，序列全選，用Align by Clustal W進行多重序列比對，比對結束后，選擇菜單欄中Analysis選項中的 phylogeny Construct/Test Neighbor Joining Tree選項進行序列數據的統計，然后計算分枝間的遺傳距離。Boostrap值設置為1 000來分析分支系統發育樹各分支聚類的穩定性。

2 結果與分析

2.1 菌株分離與形態鑒定

經過連續6個月的土壤菌株馴化培養，再通過平板劃線分離技術，得到一株以草甘膦為唯一碳源的菌株，將其命名為CGL-1，該菌株在光學顯微鏡下觀察，菌體呈球形，無莢膜和芽孢。在LB固體培養基上30℃培養24h后，培養基上呈黃色、表面光滑、微隆起、邊緣整齊的菌落。革蘭氏染色實驗鑒定結果顯示該菌為革蘭氏陽性菌。

2.2 菌株生長曲線

如圖1所示，CGL-1菌在液體搖瓶培養初期細菌由于主要在適應培養環境以及為對數生長期的快速繁殖合成必要的前體物質而生長緩慢，在2～14h培養時間內菌株處于對數生長期，該期間CGL-1菌快速繁殖，菌濃度越來越高；培養14h之后由于培養液營養物質消耗殆盡以及有害次生代謝產物的積累導致菌株生長量低于死亡量，細菌進入衰亡期。

2.3 菌株耐草甘膦最高濃度

如圖2所示，當發酵液中草甘膦濃度在0～1200mg/L濃度范圍內，30℃，170r/min，培養1 d，測定OD600值，結果各梯度濃度下CGL-1菌活性隨草甘膦濃度的增加而提高，草甘膦濃度為1 200 mg/L時菌活性最高；但當草甘膦濃度大于1 200mg/L之后 CGL-1菌活性逐漸下降。實驗結果表明，CGL-1菌對草甘膦具有較好的耐受性，但草甘膦濃度過高會抑制CGL-1生長，CGL-1對草甘膦的最高耐受濃度為1 200 mg/L。

圖2 CGL-1菌耐草甘膦活性

2.4 細菌系統發育樹分析

如圖3所示，CGL-1與9株同源關系較近的模式菌株形成了2個不同的分支，表明這些菌株屬于2個不同的亞群，CGL-1與云南微球菌Micrococcusyunnanensis(KC514114)親緣關系最近，通過對CGL-1菌16S rRNA同源性分析以及構建系統進化樹分析進一步驗證了本實驗分離得到的降解草甘膦的菌株CGL-1為微球菌屬。

圖3 CGL-1菌系統進化樹

3 小結與討論

草甘膦的分解主要要靠土壤中的微生物對它的降解作用。自1983年Moore等分離到第一株降解草甘膦的假單胞菌菌株(Pseudomonassp.)后，陸續有多株降解微生物被分離。早期分離到的菌株大多以草甘膦為磷源，這些細菌菌株分屬于產黃菌屬(Flavobacteriurn) 、節桿菌屬(Arthrobacter)、產堿桿菌屬 (Alcaligenes)及根瘤菌科(Rhizobiaceae)中[10～13]。近年來，從擬青霉(Paecilomycesvarioti)、克柔假絲酵母(Candidakruseis)、黑曲霉(Aspergilusniger)等真菌中也分離到了多株可降解草甘膦的菌株[14～17]。但有關微球菌屬草甘膦農藥降解菌的報道還很少見到，本實驗從農藥馴化土壤中分離篩選出一株潛在的降解草甘膦的菌株CGL-1，該菌株通過形態學，16S rDNA同源性分析以及構建系統進化樹等方法鑒定為微球菌屬。菌株CGL-1能在以草甘膦為唯一碳源的無機鹽培養基中生長良好，對草甘膦的最高耐受濃度為1 200mg/L，顯示對草甘膦具有較好的降解效能。后續CGL-1對草甘膦的降解效能以及田間試驗將是本研究的重點工作。CGL-1菌的分離豐富了草甘膦農藥降解菌資源，在被污染的土壤和污水等環境的生物修復中具有很大的應用潛力，同時應該深入研究降解菌有關酶和基因，本人認為將降解草甘瞵的基因克隆后轉入農作物，使草甘膦在農作物中快速催化代謝為無毒產物的研究是今后該領域的研究熱點。

參考文獻

[1]陳云.除草劑草甘膦的性質和應用[J].湖北化工,1995(2):10～11.

[2]盧信,趙炳梓,張佳寶，等.除草劑草甘膦的性質及環境行為綜述[J].土壤通報,2005,36(5):147～152.

[3]李亮.Ⅱ型 EPSP合酶的功能域鑒定及大腸桿菌在草甘膦沖擊下的基因表達譜分析[D].北京:中國農科院,2010:1～115.

[4]楊永華,姚健,華曉梅.農藥污染對土壤微生物群落功能多樣性的影響[J].微生物學雜志,2000,20(2):23～25.

[5]毛美紅,俞婷婷,傅柳方，等.草甘膦對毛竹筍用林土壤理化性質的影響分析[J].竹子研究匯刊,2011,30(3):29～32.

[6]張偉,王進軍,高立明，等.草甘膦在水-土壤系統中的環境行為及研究進展[J].農藥,2006,45(10):649～654.

[7]Wauchope R D,Buttler T M,Hornsby A G et al.The SCS/ARS/CES pesticide properties database for environmental decision-making[J].Rev Environ Contam Toxicol,1992,123(6):1～155.

[8]徐晶,王迎迎,蒲國鋒，等.草甘膦農藥在土壤中殘留研究進展[J].吉林蔬菜,2017(6):40～42.

[9] Araújo A S F,Monteiro R T R,Abarkeli R B.Effect of glyphosate on the microbial activity of two Brazilian soils [J].Chemosphere,2003,52(5):799～804.

[10] 韓麗珍,劉飛,趙德剛，等.1株草甘膦降解菌的分離鑒定及特性[J]. 貴州農業科學,2012,40(12):139～142.

[11] Moore J K,Braymer H D,Larson A D.Isolation of aPseudomonassp. Which utilizes the phosphonate herbicide glyphosate [J].Applied and Environmental Microbiology,1983,46(2):316～320.

[12]Terry M,Bahhazor E,Hallas E.G1yphosate-degrading microorganisms from industrial activated sludge[J].Applied and Environmental Microbiology,1986,51(2):432～434．

[13] Pipke R,Amrhein N.Isolation characterization of amutant ofArthrobactersp.Strain GLP-1 which utilizes the herbicide glyphosate as its sole source of phosphorus and nitrogen[J].Applied and Environmental Microbiology,1988(54):2 868～2 870．

[14]Werner L,Manfred S,Benno P.Physiological aspect of glyphosate degradation in Alcaligenes spec. strain GL[J].Archives of Microbiology,1990(153):146～150．

[15]湯鳴強,尤民生.抗草甘膦酵母菌ZM-1的分離鑒定及其生長降解特性[J].微生物學通報,2010,37 (9)：1 402～1 409．

[16] Cristina R M,Enso H,Reinoso A,et a1.Biodegradation of glyphosate by wild yeasts[J].Revista Mexicana De Micologia,2004(19):45～50．

[17]石成春,郭養浩,王大奈，等.草甘膦曲霉生物降解的動力學研究[J].中國環境科學,2005,25(3):361～365.

[18]潘渠,楊志榮.一株降解草甘膦的真菌分離鑒定[J].四川大學學報(自然科學版),2001,38(1):131～133.