苯并(a)芘對細胞模型影響的初步研究

◎ 肖路遙，陳家輝，印曉玉，薛淑楠，劉 延，蔣棟磊

（揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

隨著食品工業的不斷發展，食品污染引起的疾病逐漸增多[1]。其中，多環芳烴（PAHs）的污染尤為嚴重。PAHs是一種稠合芳香環烴化合物，具有致癌潛力。許多研究已經證明[2-4]，肺癌、心臟病發病率的增加都與PAHs有關系。BaP往往在加工過程中產生，食品本身很少含有這種物質[5-6]。BaP被人體攝入后，被腸道吸收，最后通過血液循環遍布全身，對人體產生危害[7]。研究表明[8-9]，BaP具有強烈的致癌性、致病性，包括改變DNA甲基化、改變組蛋白乙酰化、引起細胞周期紊亂和信號轉導等。本文以BaP為研究對象，通過檢測細胞Ca2+水平和活性變化，篩選出對于識別BaP更敏感的細胞株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PC-12神經細胞、RAW 264.7巨噬細胞、RBL-2H3肥大細胞：中科院上海細胞庫；苯并(a)芘[Benzo(a)pyrene，BaP]：上海阿拉丁生化技術有限公司；Fluo-4 AM 5 mM、MTT細胞毒性及增殖檢測試劑盒：碧云天生物技術有限公司；酶標儀、倒置熒光顯微鏡：美國Thermo Fisher電子公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT實驗

加入100 μL重懸細胞于96孔板中，每孔約5 000個細胞，37 ℃培養過夜，使細胞完全貼壁。依次加入10 μL濃度為10～50 μmol/L的BaP，不加BaP的細胞為空白對照。每孔依次加入10 μL MTT溶液，37 ℃繼續孵育。孵育結束后，依次加入100 μL Formazan溶解液，繼續孵育。光學顯微鏡下觀察紫色Formazan結晶是否全部溶解。用酶標儀在570 nm處測定吸光度。細胞活力（cell viability）的公式如下：

式中，A（加藥）為添加BaP刺激的細胞孔板的OD值；A（調零）為沒有細胞和BaP孔板的OD值；A（空白對照）為沒有BaP刺激細胞孔板的OD值。

1.2.2 Ca2+熒光

加入100 μL重懸細胞于96孔板中，37 ℃培養使細胞完全貼壁，用PBS分別清洗細胞3次以防止培養液降解Fluo-4 AM。稀釋Fluo-4 AM母液到濃度為1 μmol/L，加入孔板后孵育30 min以完成熒光探針的裝載。裝載完成后，用PBS洗滌細胞2～3次，37 ℃再次孵育30 min，使Fluo-4 AM轉變成Fluo-4。依次加入10 μL濃度為10～50 μmol/L的BaP，將不加BaP刺激的細胞作為空白對照，37 ℃下孵育12 h。用倒置熒光顯微鏡拍攝鈣離子熒光圖，酶標儀用來測定熒光強度，設定的激發波長為460 nm，發射波長為520 nm。不同濃度BaP刺激后的熒光強度與該細胞空白對照的比值（F/F0）為相對熒光強度，用來表示對應的Ca2+濃度。

2 結果與分析

2.1 BaP對不同細胞活力影響的探究

圖1表明，不同濃度的BaP均能不同程度的抑制3種細胞的活力。BaP的濃度為50 μmol/L時，對3種細胞的抑制作用最強。與空白對照組相比，3種細胞的活力分別降低29.72%、15.81%和19.66%。BaP濃度為10 μmol/L時，3種細胞活力的抑制作用較小，此時對PC-12細胞活力的抑制最明顯，為18.7%。結果表明，BaP對PC-12細胞活力的抑制效果更強，且在一定范圍內，BaP的濃度越高，抑制效果越明顯。

圖1 BaP對PC-12、RAW 264.7和RBL-2H3細胞活力的影響圖

2.2 BaP對不同細胞內Ca2+濃度的影響

細胞內Ca2+濃度的變化與細胞凋亡有著緊密的聯系[10]。圖2中，A、C、E為不添加BaP的對照組；B、D、F為10 μmol/L BaP處理后的PC-12、RAW 264.7和RBL-2H3細胞。3種細胞在10 μmol/L的BaP處理后均出現明顯的熒光點。相比于其他兩種細胞，PC-12細胞的熒光更為強烈。實驗表明，3種細胞的Ca2+濃度在BaP處理后均升高，PC-12細胞的Ca2+濃度變化更為明顯。

圖2 BaP對PC-12、RAW 264.7和RBL-2H3細胞內Ca2+水平的影響圖

圖3表明，不同濃度的BaP均能顯著改變胞內Ca2+的濃度。PC-12熒光強度的變化更為強烈，抑制作用更明顯。已有相關的研究表明，BaP能影響胞內鈣離子濃度的變化，進而誘導細胞凋亡[11]。運用SPSS對3種細胞的細胞活力與熒光強度之間的相關性進行分析，得出PC-12細胞的兩者相關系數為-0.880 7，RAW 264.7細胞為-0.413 1，而RBL-2H3細胞為-0.669 2，所以PC-12細胞更敏感。

圖3 BaP對PC-12、RAW 264.7和RBL-2H3細胞內Ca2+水平的影響圖

3 結論

結果表明，PC-12神經細胞活力與Ca2+濃度變化之間的相關性更高，說明PC-12神經細胞對于BaP更靈敏。為今后對于BaP在細胞方向上的研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1]陳錫文，鄧 楠，韓 俊，等.中國食品安全戰略研究[M].北京：化學工業出版社，2004.

[2]Zhou Z， Yang X， Jin L， et al. Quantitative structureactivity forecast of the PAHs toxicity by using the supporting vector machine[J]. Journal of Safety & Environment，2017.

[3]Agudelocasta?eda D M， Teixeira E C， Schneider I L， et al. Exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons in atmospheric PM1.0 of urban environments: Carcinogenic and mutagenic respiratory health risk by age groups[J].Environmental Pollution，2017，224：158-170.

[4]Ofomatah A C， Okoye C. Contamination levels， toxicity profiles， and emission sources of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in the soils of an emerging industrial town and its environs in the Southeastern Nigeria.[J]. Environmental Monitoring & Assessment，2017，189（12）：623.

[5]史巧巧，席 俊，陸啟玉.食品中苯并芘的研究進展[J].食品工業科技，2014，35（5）：379-381.

[6]黃超群，付馨慰，樓成杰，等.植物油中苯并(a)芘殘留標準樣品的研制[J].理化檢驗-化學分冊，2015，51（6）：862-864.

[7]楊兆靜.活性炭對焦化廢水中苯并[a]芘的去除工藝研究[D].臨汾：山西師范大學，2013.

[8]Yuan L，Liu J，Deng H，et al. Benzo[a]pyrene induces autophagic and pyroptotic death simultaneously in HL-7702 human normal liver cells[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，2017.

[9]Bak Y，Jang H J，Seo J H，et al. Benzo[a]pyrene alters the expression of genes in A549 lung cancer cells and cancer stem cells[J]. J Microbiol Biotechnol，2018.

[10]Liu L，Chang X，Zhang Y，et al. Fluorochloridone induces primary cultured Sertoli cells apoptosis: Involvement of ROS and intracellular calcium ions-mediated ERK1/2 activation.[J].Toxicology in Vitro，2017，47：228-237.

[11]Lian L F，Chen Y Q，Hou H Y，et al. Effect of Kaempferol on the BaP Induced Apoptosis in Human Chorionic Trophoblast Cells HTR8/SV neo[J]. Journal of International Obstetrics & Gynecology，2014.