高效液相色譜法測定植物油中黃曲霉毒素B1含量的不確定度評定

◎ 烏吉木

（巴彥淖爾市食品藥品檢驗所，內蒙古 巴彥淖爾 015000）

1 概述

1.1 測量依據

GB 5009.22-2016《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》。

1.2 測量環境

溫度：20 ℃；相對濕度：37%RH。

1.3 測量設備及試劑

安捷倫1260附熒光檢測器，C18，填料直徑5μm，內徑4.6 mm，柱長250 mm，柱后衍生：用AURAINDUSTRIES instrumentation for science碘衍生柱；電子分析天平0～200 g 0.01 g Ⅲ級；黃曲霉毒素免疫親和層析柱：VICAM Made in the U.S.A； 甲 醇（CH3OH）： 色 譜 純Honeywell；黃曲霉毒素B1標準品：國家糧食局科學研究院（質量濃度1.96 μg/mL，不確定度0.09 μg/mL）。

1.4 測量對象

植物油。

1.5 測量方法

準確稱取試樣5.0 g于50 mL離心管中，加入1.0 g氯化鈉及加入甲醇-水（7+3）至25 mL（V1）搖勻提取2 min，定量濾紙過濾，準確移取10.0 mL（V2）濾液并加入10.0 mL（V3）水稀釋，用定量濾紙過濾一次，備用。臨用時搖勻。

凈化：將免疫親和柱連接于20.0 mL一次性注射器下。準確移取10.0mL（V4）樣品提取液注入一次性注射器內，接注射器上方手推注射器讓液體以約6 mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2～3 mL空氣通過柱體。以10 mL水淋洗柱子兩次，棄去全部流出液，并使2～3 mL空氣通過柱體。準確加入1.0 mL（V）色譜級進口甲醇洗脫，流速為1～2 mL/min，收齊全部洗脫液于玻璃試管中，在50 ℃下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干，用流動相定容至2.0 mL，旋渦30 s溶解殘留物，經濾膜（0.22 μm）過濾后進高效液相色譜儀，具體見表2，然后由公式計算出黃曲霉毒素B1的含量。

2 數學模型

式中，C為樣液中黃曲霉毒素B1的濃度（μg/L）；m為樣品質量（g）；V為最終甲醇洗脫液體積（mL）；w為最終凈化洗脫液所含試樣質量（g）；V1為樣品和提取液總體積（mL）；V2為稀釋用樣品濾液體積（mL）；V3為稀釋液體積（mL）；V4為通過親和柱的樣品提取液體積（mL）；X為樣品中黃曲霉毒素B1的含量（μg/kg）。

3 標準不確定度評定

3.1 A類不確定度的計算

實驗操作人員技術水平，儀器設備的性能均會影響結果的重復性，以重復條件下標準偏差量化。該不確定度屬A類評定，對同一樣品進行10次重復測定，實驗結果見表1。

表1 黃曲霉毒素B1的測定重復性表

3.2 B類不確定度的計算

3.2.1 樣品稱量引起的不確定度

TD2002A型電子天平準確稱取試樣5.0 g（精確到0.01 g），檢定證書給出最大允許誤差0.05 g（0≤m≤500 g）。由天平引入的不確定度可按B類評定，屬均勻分布，樣品稱量引入的相對不確定度：

3.2.2 標準溶液引起的不確定度

（1）本方法采用的黃曲霉毒素B1標準溶液濃度為1.96 μg/mL，不確定度0.09 μg/mL，k=2為B類評定u標1=0.09/2=0.045。

（2）該標準溶液經2次稀釋配成標準工作液，即準確移取1.3 mL黃曲霉毒素B1標準溶液于25 mL容量瓶中，用甲醇水定容至刻度并充分混勻得到標準儲備液，準確移取1.0 mL標準儲備液于10 mL容量瓶中用甲醇水定容至刻度并充分混勻得到標準使用液。

第1次稀釋，定容引起的不確定度：依據JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規程》2.0 mL移液管A級允許誤差±0.012 mL，按B類評定，正態分布，99%概率計相對不確定度：

25 mL容量瓶的體積容量允許誤差±0.03 mL，相對不確定度：

3.2.3 曲線擬合產生的相對標準不確定度

本實驗共選取5個標準濃度，每個標準點重復測定3次，不同濃度標準溶液的峰面積測定結果見表1。

由表2的數據擬合得到線性方程：A=1.764 01C，斜率k=1.764 01，相關系數r=0.999 656，標準曲線偏差數據計算結果見表3。

表2 不同濃度黃曲霉毒素B1標準溶液的測定結果表

表3 標準曲線偏差數據計算結果表

3.2.4 標準溶液配制過程量器校準產生的相對標準不確定度

標準溶液配制工程中使用了表4中一系列的玻璃量具，均有相應的最大允差按矩形分布考慮由此計算出相對應標準不確定度分量見表4。

表4 標準溶液配制過程中量具校準引起的相對標準不確定度表

由表4合成：

最后配制標準工作液的相對不確定度如下：

3.2.5 檢測方法引起的不確定度

該方法依據GB5009.22-2016測定過程包括樣品的提取、凈化、淋洗、濃縮、定容等過程中都會引入誤差，但在實際使實驗過程中樣品的提取、過濾、免疫親和柱凈化等操作引入的不確定度是難以量化的，結合實際工作可以引入回收率。

本方法中加標回收率分別為89.52%，90.08%，83.60%，83.44%，87.44%，85.08%，83.08%，85.48%，平均值為85.965%，標準偏差為：

樣品回收率的不確定度u回=S回

3.3 不確定度的合成

依據不確定度合成公式，該植物油樣品中黃曲霉毒素B1的不確定度分量值見表5。

表5 植物油樣品中黃曲霉毒素B1含量的測量不確定度分量值表

各相對標準不確定度分量合成：

取置信概率P=95%，k=2，則擴展確定度為：

植物油中黃曲霉毒素B1測量結果為：

3.4 環境溫度引起的不確定度

實驗室環境溫度的變化會引起試劑體積的變化，導致實驗誤差增大。本實驗室內環境溫度用空調控制室溫在20 ℃，變化較小，由溫度變化引起的不確定度本文沒有參與評定。

4 結論

采用高效液相色譜法測定植物油樣品中黃曲霉毒素B1含量時，影響測量不確定度的主要因素為電子天平示值誤差、移液管和容量瓶等使用引起的容量允差、標準溶液的配制、方法的回收率、溫度變化、儀器設備引入的測量重復性誤差，通過分析表5中不確定度分量得到，影響黃曲霉毒素B1含量的最主要因素是測量重復性、方法的提取回收率、標準溶液的配制。