慢性乙型肝炎患者中Ficolin—2與肝臟炎癥的相關性研究

胡敏

【摘要】 目的：研究HBV感染后慢性肝炎患者中纖維凝膠蛋白2（Ficolin-2）的表達及其與肝臟炎癥進展之間的關系。方法：研究對象為101例HBV感染后慢性肝炎患者和120例健康對照者，采用酶聯免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血漿Ficolin-2水平，全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）水平，實時熒光定量PCR技術（real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）檢測HBV DNA含量。結果：慢性肝炎患者血漿Ficolin-2水平明顯高于健康對照組[（24.19±11.05）μg/ml vs （11.77±5.55）μg/ml]，差異有統計學意義（P<0.01），ALT水平也明顯高于健康對照組[（156.22±72.55）IU/L vs （20.58±8.87）IU/L]，差異有統計學意義（P<0.01），線性回歸分析表明血漿Ficolin-2水平與ALT水平呈正相關（R=0.813，R2=0.661，P<0.01），而與HBV DNA含量未見明顯相關性（R=0.105，R2=0.011，P=0.296）。結論：HBV感染后慢性肝炎患者血漿中Ficolin-2的表達與肝臟炎癥程度密切相關，可以作為一個有效的輔助指標來評價肝臟炎癥程度。

【關鍵詞】 纖維凝膠蛋白2； 乙型肝炎病毒； 慢性肝炎； 丙氨酸轉氨酶； HBV DNA

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.8.002 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2018）08-0003-04

The Correclation between Ficolin-2 and Hepatic inflammation in Chronic Hepatitis Patients with HBV Infection/HU Min.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（8）：3-6

【Abstract】 Objective：To investigate the possible relationships between expressions of Ficolin-2 and the progression of chronic HBV infection.Method：Ficolin-2 concentrations were measured by an enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） in the plasma of 101 chronic hepatitis patients with HBV infection and 120 healthy controls.Alanine aminotransferase（ALT） levels were detected using an automatic biochemical analyser.HBV DNA concentrations were measured using commercial realtime RT-PCR kits on an Applied Biosystems Prism 7500 seuqence detector.Result：Plasma levels of Ficolin-2 was （24.19±11.05） μg/ml in chronic hepatitis patients with HBV infection，it was higher than（11.77±5.55）μg/ml in healthy controls（P<0.01），and the result of ALT was （156.22±72.55）IU/L in chronic hepatitis patients with HBV infection，it was higher than （20.58±8.87）IU/L in healthy controls（P<0.01）.Ficolin-2 levels were positively related to the concentrations of ALT（R=0.813，R2=0.661，P<0.01），and had no relattions with HBV DNA（R=0.105，R2=0.011，P=0.296）.Conclusion：High expressions of Ficolin-2 is associated with hepatic inflammation in chronic hepatitis patients with HBV infection，and can be considered as an additional useful marker of liver inflammatory degree.

【Key words】 Ficolin-2； Hepatitis B virus； Chronic hepatitis； Alanine aminotransferase； HBV DNA

First-authors address：Tongcheng Peoples Hospital，Tongcheng 437400，China

機體的天然免疫可以中和病毒感染、觸發炎癥、促進吞噬細胞吞噬病原體并調節適應性免疫應答，在病毒感染后的識別及病原體的清除過程中有重要作用[1]。天然免疫系統有多種不同的識別和效應機制，其中就包括補體系統[2]。補體是先天體液免疫的關鍵因子，某些補體成分，如C型凝集素、纖維膠凝蛋白（Ficolin）等在病毒感染細胞、被包圍病毒粒子的溶解及病毒的清除過程中發揮著重要作用[3]。Ficolin屬于重要的人血清補體凝集素，目前人體內已發現的Ficolin有3種，分別是Ficolin-1（M-Ficolin）、Ficolin-2（L-Ficolin，又稱Ficolin/P35）和Ficolin-3（H-Ficolin），其結構與甘露聚糖結合凝集素（Mannan-binding lectin，MBL）類似[4-5]。近年的來研究表明，Ficolin作為一種可溶性的糖類識別蛋白，可以與乙酰葡萄糖、LPS及某些病原微生物（包括細菌、真菌和病毒）等結合激活補體凝聚素途徑[6-7]。慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是嚴重危害人類健康的重要傳染病之一，HBV病毒與機體免疫系統間感染和抗感染的關系是疾病發生發展的重要機制。本研究旨在探討慢性乙型肝炎患者中血漿Ficolin-2的表達與肝臟炎癥間的關系，并探討其可否作為一個有效的輔助指標來評價肝臟的炎癥程度。

1 資料與方法

1.1 一般資料

全部病例來自2016年1-6月通城縣人民醫院門診或住院的慢性乙型肝炎患者，實驗室檢測HBV DNA>103 IU/ml，共101例，所有入選病例符合文獻[8]2015年中華醫學會肝病與感染病學分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標準，排除其他肝炎病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝炎、脂肪肝及藥物性肝病等因素干擾，排除混合（重疊）感染的情況。所有病例均排除心、腦、腎、肺等器官疾病及高血壓、糖尿病等疾病。其中男60例，女41例；年齡17～65歲，平均（39±14）歲。健康對照者120例，為病例收集期間的健康體檢者，其中男66例，女54例；年齡16～66歲，平均（40±15）歲，排除肝臟、心腦血管、內分泌和腎臟疾病者。

1.2 儀器和試劑

Ficolin-2 ELISA檢測試劑盒（Hycult生物技術公司）；ALT檢測試劑盒（上海科華生物工程股份有限公司）；HBV核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法，中山大學達安基因有限公司）；Thermo Multiskan MK3 全自動酶標儀（芬蘭Thermo公司）；7600-020型全自動生化分析儀（日立公司）；Prism 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 血漿Ficolin-2水平檢測 采用ELISA法檢測血漿Ficolin-2的水平，嚴格按試劑盒說明操作：將標準品及待測血漿50 μl/孔加入包被有Ficolin-2抗體的96孔板，37 ℃溫育1 h；PBS洗滌3次，加入酶標抗體100 μl/孔，37 ℃溫育0.5 h；

PBS洗滌3次，加入TMB 100 μl/孔，于室溫下顯色15 min，再每孔加入1滴終止液終止反應。在MK3酶標儀進行檢測，通過標準曲線計算出標本Ficolin-2含量。

1.3.2 血漿ALT水平檢測 采用全自動生化分析儀（速率法）檢測血漿ALT水平嚴格按照說明書操作。

1.3.3 血漿HBV DNA水平檢測 血漿HBV DNA的提取、擴增、檢測及結果分析嚴格按照達安公司試劑盒說明書（試劑檢測限500 IU/ml）操作，采用Prism 7500熒光定量PCR儀進行HBV DNA水平檢測。

1.4 統計學處理

統計分析均采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料用以（x±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗，兩者間線性關系分析采用線性回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿Ficolin-2、ALT水平和HBV DNA含量

健康對照組、慢性肝炎患者血漿Ficolin-2、ALT水平和HBV DNA含量如表1所示：慢性肝炎組Ficolin-2、ALT水平明顯高于健康對照組（P<0.01）；對其HBV DNA含量取對數，慢性肝炎組均值為5.12±1.35，而健康對照組低于試劑檢測限，慢性肝炎組明顯高于健康對照組。

2.2 慢性肝炎患者血漿Ficolin-2水平與ALT水平的關系

如圖1所示，線性回歸分析發現，101例慢性肝炎患者血漿中Ficolin-2水平與ALT呈正相關（R=0.813，R2=0.661，F=193.244，P<0.01）。

2.3 慢性HBV患者血漿Ficolin-2水平與HBV DNA含量的關系

如圖2所示，線性回歸分析表明，101例慢性肝炎患者血漿中Ficolin-2水平與HBV DNA含量無明顯相關性（R=0.105，R2=0.011，F=1.103，P=0.296）。

3 討論

Ficolin本質是一組糖蛋白，主要由肝臟產生，在體內廣泛分布。它的編碼基因位于第9號染色體長臂上，含有8個外顯子。血漿中Ficolin-2是由三鏈亞單位組成的有序的寡聚體，每條肽鏈的相對分子量為35 kDa，其結構是由含13個氨基酸的N末端、帶有Gly-Xaa-Yaa三聚體重復序列的膠原樣區、9個氨基酸組成的頸區和長達209個氨基酸的C末端等4個功能區組成[9-10]。據報道，Ficolin-2在三種亞型中最先被克隆的，其結構類似于MBL、C1q和肺表面活性蛋白（lung surfactant proteins）A和D（SP-A 和 SP-D），在機體抗感染過程早期中發揮著重要作用[4]。

在感染病原體早期，機體內的吞噬細胞會分泌一系列細胞因子，這些細胞因子的釋放會刺激肝細胞合成分泌多種急性期反應蛋白，其中就包括了能夠激活補體的有MBL以及C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）等。當MBL與病原體表面的甘露糖殘基識別后，與MBL相關絲氨酸蛋白酶（MBL-associated serine protease，MASP）結合，使本來沒有活性的MASP發生結構改變，從而成為活化的MASP。MASP包括MASP-1、MASP-2和MASP-3三種亞型，均能與MBL結合。研究表明，活化的MASP是具有水解補體活性的酶，可以水解補體C4和C2，隨后的反應過程就與經典補體激活途徑相同，此種補體活化的途徑即為MBL途徑或凝集素途徑[9]。也有研究表明，Ficolin也能通過此途徑發揮作用[11-12]。Ficolin-2或Ficolin-3識別其各自相應的配體并與之結合可以激活MASP-1，成為活化的MASP，后者裂解MASP-2使之激活水解C4和C2，從而產生凝集素途徑的C3轉化酶C4b2b[11-12]。此外，也有報道Ficolin也可以通過調理吞噬作用參與機體的抗感染過程[13-14]。

目前，有關Ficolin與病毒感染性疾病間的研究不多。Keirstead等[15]報道Ficolin分子在體外可降低豬繁殖及其與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的感染性。Hu等[16]也曾報道，HCV感染者中血漿Ficolin-2水平與肝臟炎癥嚴重性以及抗病毒療效密切相關。Pan等[17]研究表明，注射了pcD-NA3.1-L-ficolin真核質粒的小鼠體內的Ficolin-2可能與病毒表面糖蛋白HA、NA相互作用，因而小鼠對流感病毒感染表現出較強的抵抗力。本研究表明，慢性HBV肝炎患者血漿Ficolin-2水平明顯增加，提示HBV感染機體后可能長期刺激肝細胞Ficolin-2的表達，使其含量升高，從而成為機體對抗HBV感染的一種天然免疫分子。此外，慢性肝炎的病理改變主要是免疫損傷，炎性因子的作用可能影響疾病的進展。當肝細胞千分之一有炎癥時，血清ALT含量就會增高一倍以上，血漿ALT是肝臟炎癥程度的重要指標。本研究進一步研究發現，血漿中Ficolin-2與ALT水平呈正相關，與HBV DNA含量未見明顯相關性，表明慢性肝炎時血漿Ficolin-2的表達與肝臟炎癥程度密切相關，但與病毒本身的活躍程度無關。

慢性HBV感染的病理機制非常復雜，涉及遺傳、免疫和環境因素等多種因素。本研究表明，慢性肝炎患者血漿中Ficolin-2的表達與肝臟炎癥程度呈高度正相關，因而其可能作為一個有效的輔助指標來評價肝臟的炎癥程度。

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（收稿日期：2017-09-27）