根痛平片微生物限度檢查方法研究

姬 俊 ，牛萌萌 ，劉彩娜 ，王立云

（1．山東省青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266073； 2．山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 山東省眼科研究所 青島眼科醫(yī)院，山東 青島 266071）

根痛平片是由伸筋草、白芍、燙狗脊、續(xù)斷、地黃、紅花、醋乳香、醋沒藥、桃仁、牛膝、葛根、甘草制成的中成藥，方中白芍、紅花、桃仁、乳香、沒藥為君藥[1]，功能主治活血、通絡(luò)、止痛，用于風(fēng)寒阻絡(luò)所致頸椎病，癥見肩頸疼痛、活動受限、上肢麻木等[2]。目前，全國有4家藥品生產(chǎn)企業(yè)有批準(zhǔn)文號。根據(jù)2015年版《中國藥典(四部)》通則1105和1106的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查的相關(guān)方法[3]，本研究中對3家企業(yè)的根痛平片進(jìn)行了微生物限度方法適用性試驗(yàn)，建立了適用于該產(chǎn)品的微生物限度檢查方法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

1．1 儀器

INE500型電熱恒溫培養(yǎng)箱（德國美墨爾特公司）；H·SWX-600BS型電熱恒溫水溫箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；SHP-160E型生化培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；PYX-DHS-40×50型隔水式培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；TD型電子天平（浙江省余姚市金諾天平儀器有限公司）。

1．2 材料

培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號為3105660），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號為3105589），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號為3104045），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號為 3104833），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號為3303011），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號為 3104618），腸道增菌液體培養(yǎng)基（批號為3104849），紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號為3104750），RV沙門增菌液體培養(yǎng)基（批號為3104847），木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（批號為3104652），均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供，均符合2015年版《中國藥典》培養(yǎng)基適用性檢查的規(guī)定。

菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、枯 草 芽 孢 桿 菌 （Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]、白色念珠菌（Candida albicans） [CMCC（F） 98 001]、 黑 曲 霉 （Aspergillus niger）[CMCC（F） 98 003]、 大 腸 埃 希 菌 （Escherichia coli）[CMCC（B）44 102]、乙 型 副 傷 寒 沙 門 菌 （Salmonella paratyphi B）[CMCC（B）50 094]為傳代不超過 5 代的菌種，均由中國食品藥品檢定研究院提供。

試藥：根痛平片（承德燕峰藥業(yè)有限責(zé)任公司＜ A 廠 ＞，規(guī)格為每片 0．3 g，批號分別為 16914014，16914024，16914025；海口市制藥廠有限公司 ＜B廠＞，規(guī) 格 為 每 片 0．3 g， 批 號 分 別 為 160701， 160803，161201；北京斯利安藥業(yè)有限公司＜C廠＞，規(guī)格為每片0．5 g，批號分別為 GP170302，GP170303）。卵磷脂（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，批號為20170302）；聚山梨酯80（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號為20151014）。

2 方法與結(jié)果

2．1 菌液制備

按2015年版《中國藥典（四部）》通則1105，1106要求制備：將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、沙門菌接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，于30～35℃培養(yǎng)24 h；將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于20～25℃培養(yǎng)3 d；將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，于20～25℃培養(yǎng)7 d。取上述金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、沙門菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用0．9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取上述黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入 5 mL含 0．05%聚山梨酯 80的0．9%無菌氯化鈉溶液，洗脫孢子，將菌懸液吸至無菌試管中，用含0．05%聚山梨酯80的0．9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2．2 供試液制備

取供試品10 g，以胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基為稀釋液，加稀釋液制成1∶10供試液（不含中和劑），取此1∶10供試液（不含中和劑）用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基梯度稀釋制成 1∶100，1∶1 000供試液 1（不含中和劑）。取供試品10 g，以含3%聚山梨酯80和0．3%卵磷脂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（以下簡稱含中和劑的稀釋液）為稀釋液，加此含中和劑的稀釋液制成1∶10供試液（含中和劑），取此1∶10供試液（含中和劑）用含中和劑的稀釋液梯度稀釋制成1∶100，1∶1 000供試液2（含中和劑）。

2．3 計數(shù)方法適用性試驗(yàn)

試驗(yàn)組：采用平皿法，取2．2項(xiàng)下供試液1，2各9．9 mL分別置于無菌試管中，在試管中分別加入2．1項(xiàng)下金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液各0．1 mL，混勻，使每1 mL供試液中含菌量≤100 cfu，取上述含有菌液的供試液1 mL注入平皿中，立即傾注15～20 mL熔化的瓊脂培養(yǎng)基（溫度不超過45℃）。菌液對照組：取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌進(jìn)行試驗(yàn)。供試品對照組：取相應(yīng)的供試液，用相應(yīng)稀釋液代替菌液，照試驗(yàn)組方法進(jìn)行試驗(yàn)。中和劑對照組：取相應(yīng)的含中和劑的稀釋液代替供試品，照試驗(yàn)組方法進(jìn)行試驗(yàn)。各組平行制備2個平皿，用于需氧菌計數(shù)的平皿使用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，于30～35℃培養(yǎng)；用于霉菌和酵母菌計數(shù)的平皿使用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，于20～25℃培養(yǎng)。

2．4 計算

供試品試驗(yàn)組的回收結(jié)果＝（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)-供試品對照組的平均菌落數(shù)）／菌液對照組的平均菌落數(shù)；稀釋劑對照組的回收結(jié)果＝稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)／菌液對照組的平均菌落數(shù)。結(jié)果見表1至表2。可見，中和劑能降低根痛平片對枯草芽孢桿菌的抑菌作用，使所選的3家企業(yè)的8批樣品稀釋到1∶100時對枯草芽孢桿菌的回收結(jié)果均為0．5～2，符合藥典要求。由表2可知，稀釋劑對照組回收結(jié)果為0．5～2，分別對3家企業(yè)的藥品進(jìn)行計數(shù)方法適用性試驗(yàn)，結(jié)果都符合藥典要求。可用含中和劑的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備供試液，取1∶100供試液（含中和劑）按照平皿法進(jìn)行根痛平片的微生物限度的計數(shù)檢查。

2．5 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

2．5．1 大腸埃希菌

試驗(yàn)組：取2．2項(xiàng)下1∶10供試液（不含中和劑）10mL和菌量≤100 cfu的大腸埃希菌接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。陽性對照試驗(yàn)組：取菌量≤100 cfu的大腸埃希菌接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。供試品對照組：取 2．2項(xiàng)下1∶10供試液（不含中和劑）10 mL至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。陰性對照試驗(yàn)組：取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基10 mL接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。以上各組于30～35℃培養(yǎng)24 h后，分別取上述各組培養(yǎng)物1 mL接種于麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44℃培養(yǎng)48 h。將其培養(yǎng)物分別劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng) 72 h。

表1 根痛平片對枯草芽孢桿菌的計數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

表2 根痛平片微生物計數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2．5．2 耐膽鹽革蘭陰性菌

預(yù)培養(yǎng)：取 2．2項(xiàng)下 1∶10，1∶100，1∶1 000 供試液（不含中和劑）10 mL置于無菌試管中，于20～25℃培養(yǎng) 2 h。試驗(yàn)組：分別取以上 1 ∶10，1 ∶100，1 ∶1 000 供試液1 mL和菌量≤100 cfu的大腸埃希菌接種或銅綠假單胞菌至10 mL腸道增菌液體培養(yǎng)基中。陽性對照試驗(yàn)組：取菌量≤100 cfu的大腸埃希菌或銅綠假單胞菌接種至10 mL腸道增菌液體培養(yǎng)基中。供試品對照組：分別取以上 1∶10，1∶100，1∶1 000供試液 1 mL 至 10 mL腸道增菌液體培養(yǎng)基中。陰性對照試驗(yàn)組：取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1 mL接種至10 mL腸道增菌液體培養(yǎng)基中。以上各組于30～35℃培養(yǎng)48 h后，將上述各組培養(yǎng)物接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)24 h。

2．5．3 沙門菌

試驗(yàn)組：取供試品10 g和菌量≤100 cfu的沙門菌接種至200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。陽性對照試驗(yàn)組：取菌量≤100 cfu的沙門菌接種至200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。供試品對照組：取供試品10 g至200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。陰性對照試驗(yàn)組：200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。以上各組于30～35℃培養(yǎng)24 h后，分別取上述各組培養(yǎng)物0．1 mL接種于RV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24 h。將其培養(yǎng)物分別劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)48 h。結(jié)果見表3。可見，試驗(yàn)組檢出陽性菌，供試品對照組和陰性對照試驗(yàn)組均為陰性。因此，可按以上控制菌的檢查方法對大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌進(jìn)行檢驗(yàn)。

表3 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

根痛平片由12味中藥制成，除部分白芍粉碎成細(xì)粉直接混合制粒，其他中藥均經(jīng)水煎煮。研究表明，白芍、紅花、伸筋草、狗脊、乳香、牛膝的水提物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等有不同程度的抑制作用[4-9]。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，根痛平片對藥典中用于方法適用性試驗(yàn)要求的枯草芽孢桿菌的抑制作用明顯強(qiáng)于其余4種菌。因此，首先篩選出能消除根痛平片對枯草芽孢桿菌的方法，進(jìn)而確定根痛平片的菌落計數(shù)方法。

考察常規(guī)平皿法時，采用不同稀釋條件，對枯草芽孢桿菌進(jìn)行回收試驗(yàn)。結(jié)果只有北京斯利安藥業(yè)有限公司的供試品在1∶50稀釋級能使回收符合要求，其他2家的供試品在1∶100稀釋級的回收結(jié)果均小于0．5。聚山梨酯80和卵磷脂聯(lián)用能降低藥物的抑菌作用[10-11]，故采用這2種中和劑來消除成分復(fù)雜的根痛平片的抑菌作用。使用含中和劑的稀釋劑制備供試品，需要制備成1∶100供試液，才能使3家企業(yè)的供試品對枯草芽孢桿菌的回收均為0．5～2，符合藥典要求。

綜上，平皿法和中和劑聯(lián)用能消除根痛平片對枯草芽孢桿菌的抑制，可為其微生物限度檢查方法提供參考。

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