烏司他丁對膿毒癥大鼠膈肌p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路的影響

馮清洲，劉 ，黃建鑫

(廣東省深圳市第七人民醫院重癥醫學科，廣東 深圳 518081)

膿毒癥是一種由重癥感染引起的全身炎性反應綜合征，持續發展可引起機體器官衰竭[1]。研究顯示，烏司他丁能有效抑制膿毒癥膈肌p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號通路的表達[2-3]，但也有學者對此提出了質疑。本研究中擬用脂多糖（LPS）刺激巨噬細胞形成膿毒癥，檢測細胞上清液脂肪球表皮生長因子8(MFG-E8)表達水平，并測定p38 MAPK的活性變化，以期闡明LPS刺激巨噬細胞后MFG-E8表達的規律。經p38MAPK的特異性抑制劑SB203580干預后，檢測細胞上清液MFG-E8表達水平，并檢測p38 MAPK的活性變化，比較LPS和LPS+SB203580刺激后巨噬細胞MFG-E8表達水平的變化及p38 MAPK活性變化，探討膿毒癥MFG-E8表達的規律及其分子機制，闡明p38 MAPK在膿毒癥MFG-E8表達中的作用。現報道如下。

1 材料與方法

1．1 動物與試藥

動物：SPF級成年雄性SD大鼠60只，由醫學院實驗動物中心提供，體質量為 250～300 g，合格證編號為SCXK（浙）2003-0001號，動物飼料執行標準GB14924-2001。飼養1周后觀察其身體狀態，判斷其有無疾病或不良狀態。試驗前24 h內禁止飲食，不控制飲水。

試藥：注射用烏司他丁（廣東天普生化醫藥股份有限公司，國藥準字 H19990134，批號為 20100406，規格為每支10萬U）2 000 U腹腔注射。本研究所涉及技術均為成熟的試驗技術，我院擁有本研究所需設備和條件，課題組人員配備合理，并掌握了細胞培養、RTPCR及WESTERN-BLOT等相關試驗技術。

1．2 分組與建模

所有大鼠隨機分為A，B，C 3組，各20只。A組為假手術組，B組為膿毒癥組，C組為烏司他丁治療組。A組取 10%水合氯醛（0．35 mL／100 g）行腹腔麻醉，后將大鼠肢體固定，沿其下腹中心線正中剪開大鼠腹部，縱行切開長約2 cm切口，將其盲腸輕微拉出后納入腹腔，不做任何處理后將切口縫合。B組使用盲腸結扎穿刺（CLP）模型，將大鼠制成膿毒癥動物模型，具體操作：麻醉后，將其左頸外動脈切開，留置導管，記錄其平均動脈壓、血壓基礎值等；采用手術分層的方式打開腹腔，找到盲腸后將其末端提起，在遠端2／3盲腸部位以1．0絲線進行結扎，使用臨床18號針對盲腸實施穿刺，2次，孔1在大鼠盲腸末端，孔2在盲腸近端。輕壓盲腸，使少量腸溶物流至腹腔內，然后將盲腸納入腹腔，逐步縫合切口。術后，給予皮下注射林格液50 mL／kg體質量抗休克，觀察其血壓值變化，血壓值下降幅度超過基礎值20%且維持時間超過20 min以上，即認為達到早期膿毒性休克標準，完成試驗模型的建立。C組在制作CLP模型后，立即給予烏司他丁2 000 U腹腔注射，并于術后8 h再次注射。

1．3 膈肌肌條收縮力檢測

術后16 h內處死大鼠，即刻剖腹取出左側肋膈肌，包括中心腱和肋骨，并一同置通有95%O2與5%CO2混合氣體的林格液浴槽中，保持37．8℃。將膈肌剪成5 mm×15 mm的肌條，使肌條肋骨段固定在浴槽底部，中心腱段與經過校對的張力轉換器進行連接，張力轉換器則連接對應生理記錄儀。將肌條置2片鉑金電極之間，采用刺激儀以0．5 ms單脈沖進行刺激，每次刺激間隔2 h，且每次增加0．05 mA，當得到的肌肉收縮力不再增加時獲得最大收縮力數據。

1．4 膈肌肌細胞凋亡率檢查

對新鮮膈肌組織使用4%多聚甲醛固定，連續切片，由石蠟包埋，使用原位細胞凋亡檢查試劑盒(武漢博士德公司)TUNEL法對膈肌細胞凋亡程度進行檢測[4-5]。

1．5 統計學處理

2 結果

2．1 基本情況

A組大鼠術后基本狀態良好，行動自如，生命體征平穩，無特殊情況。腹腔內腸管正常或有少量粘連，腸黏膜正常或有輕度充血和水腫。B組大鼠術后出現不同程度精神萎靡、行動遲緩、移動減少，并有部分大鼠存在不進食現象；腹腔內有極臭的血性或膿性滲出液，臟器內有充血、水腫等情況。B組大鼠術后血壓值下降幅度超過基礎血壓值的20%，且持續20 min以上，A組無下降現象。

2．2 檢測指標

B組大鼠膈肌肌條收縮較A組有明顯下降，膈肌肌細胞凋亡率及p38 MAPK蛋白表達水平明顯上升；C組膈肌肌條收縮力較A組仍有明顯下降，膈肌肌細胞凋亡率及p38 MAPK蛋白表達水平明顯上升；C組膈肌肌條收縮力、膈肌肌細胞凋亡率及p38 MAPK蛋白表達水平較B組均有明顯改善，差異有統計學意義（P＜0．05）。詳見表1。

表1 3組大鼠檢測指標比較（±s，n＝20）

表1 3組大鼠檢測指標比較（±s，n＝20）

注：與 A 組相比，* P ＜0．05；與 B 組相比，#P ＜0．05。

組別A組B組C組膈肌肌細胞凋亡率（%）1．70 ± 1．35 25．10 ± 2．57 14．40 ± 1．06 #**p38 MAPK蛋白表達水平（×10-3）10．20 ± 3．85 149．34 ± 18．14 93．41 ± 12．03 #**膈肌肌條收縮力（ × 10-3，N ／cm2）1 034．35 ± 34．25 167．94 ± 27．39 300．50 ± 18．75 #**

3 討論

p38 MAPK是MAPKs家族中的重要成員，在將信號從細胞表面轉導進入細胞核的過程中具有重要作用[6]。多種應激、前炎性細胞因子與生長因子均可激活p38 MAPK，從而影響細胞的轉錄、蛋白合成和受體活化等生物效應。研究發現，在許多炎性反應中，如LPS處理的巨噬細胞、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激的內皮細胞、白細胞介素18(IL-18)刺激的U1單核細胞株可觀察到p38 MAPK磷酸化及活化[7-8]。另有研究表明，TNF-α，IL-1，IL-6的產生亦受 p38 MAPK信號通路的調控，p38 MAPK抑制劑對 TNF-α，IL-1，IL-6等細胞因子的合成起抑制作用[9-11]。可見，p38 MAPK信號轉導可導致多種致炎細胞因子的釋放，反過來炎性介質也能激活p38 MAPK，進而作用于p38MAPK下游底物，從而形成一個逐級放大的炎性反應過程[12-13]。因此，相關學者推測膿毒癥時通過激活p38 MAPK信號轉導通路，可進一步介導MFG-E8的表達調控。

本研究中，大鼠制作成CLP模型后膈肌收縮力明顯下降，且B組只有A組的20%左右。膈肌作為機體的主要呼吸肌，一旦出現膿毒癥造成膈肌收縮力下降，便會對機體呼吸功能造成影響，致使膿毒癥患者無法長時間撤離呼吸機。因此，對于膿毒癥膈肌損傷機制的研究及制訂有效的防治措施具有重要意義[14]。MAPK信號通路是存在于大多數細胞內的一種重要信號系統，參與了細胞生長、發育、分化、凋亡等過程，膿毒癥膈肌p38信號通路則是MAPK的一種，處于應激誘導信號，該信號通道促進凋亡的機制是機體內毒素激活p38 MAPK信號后，進一步誘使凋亡激活轉錄因子-2酸化，促使DNA斷裂，最終使細胞發生肥大和凋亡。本研究中指出，隨著p38 MAPK蛋白表達的增加，膈肌肌細胞凋亡率也明顯增加，膈肌肌條收縮力下降。烏司他丁則是在人體尿液中發現的尿胰蛋白酶抑制劑，能廣譜、高效移植多種蛋白酶、酯水解酶，并有效刺激炎性因子的釋放。膿毒癥時腸道菌群失調及細菌移位，是導致多器官功能障礙綜合征(MODs)的“始動器”，腸道作為體內最大的“免疫器官”“儲菌庫”“內毒素庫 ”，參與了 MODs的病理生理過程。MFG-E8在腸黏膜損傷后修復和腸道炎性調節中亦起了重要作用；p38 MAPK信號轉導可導致多種致炎細胞因子的釋放，反過來炎性介質也能激活p38 MAPK，因此MFG-E8參與膿毒癥的發生、發展及p38 MAPK信號轉導通路介導MFG-E8的表達調控在理論上可行[15-16]。本研究結果顯示，C組細胞凋亡率大于A組，小于B組；p38 MAPK蛋白表達水平大于A組，小于B組；膈肌肌條收縮力小于A組，大于B組。證實烏司他丁治療膿毒癥后，膈肌肌條收縮力、膈肌肌細胞凋亡率及p38 MAPK蛋白表達水平均有明顯改善，且對p38 MAPK信號通路的表達有重要影響。

綜上所述，烏司他丁可有效抑制膿毒癥膈肌p38 MAPK信號通路的表達，并有效減少膈肌肌細胞凋亡率，降低膿毒癥對膈肌造成的損傷，對于治療膿毒癥有重要意義。

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