BRAF基因在甲狀腺癌中的表達及臨床相關性研究

宋傳偉

甲狀腺癌屬于常見的內分泌惡性腫瘤之一，包括乳頭狀癌、未分化癌、濾泡狀癌以及髓樣癌，且以乳頭狀癌發生率最高，大約占所有甲狀腺癌的85%[1]。目前，甲狀腺癌的發病率逐年升高，尤其乳頭狀癌的發生情況最為明顯。甲狀腺癌治愈率也比較低，大多數患者會發生疾病復發、并發癥、癌組織遠處轉移等后遺癥，因此甲狀腺癌的治療也越來越受到人們的關注[2]。本院在對甲狀腺癌以及良性甲狀腺病變患者的診治過程中，分析BRAF基因突變與甲狀腺癌的發病機制、病理性特征、治療、診斷的臨床相關性，取得了滿意效果，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年7月～2017年7月本院收治的甲狀腺癌患者40例，其中男23例，女17例，年齡25～76歲，平均年齡（53.2±2.4）歲，乳頭狀癌25例，濾泡狀癌8例，未分化癌7例，腫瘤直徑＞1 cm有24例，≤1 cm有16例；同期收治的良性甲狀腺病變患者32例，其中男15例，女17例，年齡31～74歲，平均年齡（48.5±3.2）歲，甲狀腺結節15例，甲狀腺腺瘤8例，甲狀舌管囊腫9例。兩組患者臨床資料比較差異無統計學意義，均知情同意本研究，并經過醫院倫理委員會批準。

1.2 方法 研究組與對照組患者均采用以下的兩種方法分別觀察其BRAF基因突變情況以及BRAF蛋白表達情況。

1.2.1 BRAF基因突變情況 采用PCR擴增技術并通過測序儀對PCR擴增產物進行序列測定。首先進行DNA的提取，將8μm厚的石蠟組織進行切片處理，切分為3～4片，將其放置于1.5 ml專用試管中，將含有DNA的石蠟切片抽提試劑盒進行樣本提取，使用NanoDrop進行DNA的濃度測定，均按照試劑盒操作說明書進行[3]。其次進行引物合成，引物合成后，采用巢式PCR擴增技術進行BRAF基因的擴增。擴增完成后，取8μl PCR擴增產物，2%的瓊脂糖凝膠，1μl緩沖液，在100 V電壓下進行30 min的電泳操作，EB進行染色處理，將PCR產物純化后，使用引物BRAF-F或BRAF-R進行測序，并將測序結果通過Blast軟件與已知序列進行同源性比較，觀察BRAF基因突變情況[4]。

1.2.2 BRAF蛋白表達情況 采用免疫組化Envision兩步法，將4μm厚石蠟切片，石蠟進行常規脫至水處理，置于放有檸檬酸修復液的電飯煲中，煮沸20 min，然后將其降至室溫狀態，再滴加稀釋程度為（1∶100）的抗BRAF抗體，培養3 h，用PBS清洗3次，發現DAB正常顯色，再次用蘇木精染色一遍，脫水至透明封固處理[5]。觀察分析BRAF蛋白表達中的陽性率與陰性率。

1.3 觀察指標 通過將PCR擴增產物與基因庫中的序列進行比較，觀察BRAF突變情況。BRAF蛋白表達陽性與陰性判斷標準：腫瘤細胞核染色后為棕黃色，隨機觀察切片的5個視野，陽性細胞數占腫瘤細胞總數得百分比≥10%為陽性，即為甲狀腺癌，陽性細胞數或無著色細胞數＜10%為陰性，即良性腫瘤。

1.4 統計學方法 本研究采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以例數表示，采用χ2檢驗；計量資料采用“x±s”表示，采用t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

研究組中甲狀腺乳頭狀癌25例，有15例發生了基因突變，濾泡狀癌與未分化癌沒有發生基因突變。對照組中均無基因突變發生，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

研究組患者的BRAF蛋白表達率水平明顯高于對照組（P＜0.05），且研究組BRAF蛋白陽性者28例，陽性率為70.0%，表達陰性者12例，陰性率為30.0%，對照組BRAF蛋白表達陽性者8例，陽性率為25.0%，表達陰性者24例，陰性率為75.0%，見表1。

表1 兩組患者BRAF蛋白表達水平對比[n（%）]Table 1 Comparison of BRAF protein expression levels in the two groups[n(%)]

3 討論

BRAF基因，又稱鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，屬于RAF基因家族中的一種，位于人染色體的7q34，約190 KD大小，有94 KD能夠編碼蛋白質分子，且含有18個外顯子，783個氨基酸殘基，對MAPK信號通路的傳導有重要作用，其基因突變對于多種癌的形成均有誘導作用，甲狀腺癌是其中之一[6]。RAS和RET的下游蛋白激酶是BRAF，在15外顯子基因中的單個堿基發生突變（T1799A），會造成谷氨酸替代翻譯蛋白質的密碼子相對應的纈氨酸（V600E)，使之變成活化的蛋白激酶，從而將MEK（ERK激酶）激活以及向MAPK信號通路下游傳遞有絲分裂信號的細胞，致使腫瘤的形成。MAPK是一種信號通路，能夠對細胞的生長、繁殖、分化、凋亡起重要調控作用，影響細胞的生命周期，當它被某種因素影響導致其異常激活時，可能會促使腫瘤的形成[7]。

BRAF基因合并PTEN、RAS等基因突變通常發生在浸潤性甲狀腺癌中，尤以甲狀腺乳頭狀癌的發生最為常見，甲狀腺癌發生的重要機制之一是抑癌基因發生異常甲基化從而誘導基因沉默的發生，并使腫瘤進一步惡化。研究學者在對甲狀腺乳頭狀癌患者的研究中發現，RASSR1A抑癌基因超甲基化與BRAF基因突變具有負相關的關系，這或許暗示著BRAF基因的后天破壞可能將通過影響信號通路（MAPK通路）來誘導甲狀腺癌的形成。最新的研究表明，BRAF基因突變能夠誘導轉化生長因子TGF-β的分泌以及抑制素（PHB）的分泌，且BRAF基因突變能夠提高抑制素釋放素的活性，促進PHB的分泌，抑制素能夠潛在的對BRAF基因突變進行調節，從而促使甲狀腺乳頭狀癌的發生。BRAF基因突變經研究證實，與患者的年齡、性別、淋巴結轉移、原發灶大小、甲狀腺外侵犯以及腫瘤大小和分期沒有明顯相關性，其突變的主要原因有：①BRAF基因的異常剪接。BRAF基因的異常剪接是引起BRAF基因活化的重要誘因，研究學者通過調查甲狀腺癌患者的腫瘤組織發現，BRAF基因突變都能夠檢測到，且在甲狀腺乳頭狀癌患者中的Ⅲ期、Ⅳ期顯著高于Ⅰ期、Ⅱ期，這種異常現象的出現與腫瘤的分期、BRAF突變有明顯關系。②輻射。輻射是一種重要的致癌劑，其與DNA分子相互作用，能夠使DNA分子雙鏈裂變，導致基因重排，遭受輻射的細胞會造成基因組出現不穩定性，且相鄰的細胞即使未被輻射也會出現相同的現象，這便是旁觀者效應，最終會導致腫瘤原癌基因與抑癌基因發生變化，致使腫瘤形成[8]。致癌基因的重排包括原癌基因和抑癌基因，也包括BRAF基因的重排。有研究調查發現，在切爾諾貝利核事故發生后的20多年，當地居民甲狀腺癌的發病率增加較快，表明射線暴露也是導致甲狀腺癌的危險因子。③大量的碘攝入。研究學者通過考察分析，發現高碘攝入區比正常的碘攝入區發生BRAF基因突變的突變率要高很多，以此證明，大量碘的攝入也是一個誘導因素[9]。

雖然BRAF基因突變會誘導甲狀腺癌的形成，但其也具有重要的臨床醫學價值，對于甲狀腺癌的診治和預后有重要的作用。通過本次研究表明，BRAF基因突變率為60%，其中甲狀腺乳頭狀癌突變率最高，且在其他甲狀腺癌和良性甲狀腺病變中并未發生基因突變，國內外的文獻報道稱BRAF基因在甲狀腺乳頭狀癌中的突變率為28.4%～66.7%，本次研究結果與報道上大體上一致，表明BRAF基因是甲狀腺癌的特異基因，因此可作為診斷甲狀腺癌發生的一個標志物[10]。本次研究結果顯示，研究組患者的BRAF蛋白表達率水平明顯高于對照組（P＜0.05），表明甲狀腺癌患者體內BRAF基因蛋白表達更為顯著，腫瘤細胞繁殖率較高。對于甲狀腺癌的治療，可以通過研究某種抑制藥物，使其能抑制MAPK信號通路的異常激活，或者使某種抑制藥物能夠抑制乳頭狀癌腫瘤細胞的增殖，可能將會有效治療甲狀腺癌，治療效果還有待于進一步研究。

綜上所述，BRAF基因突變與BRAF蛋白表達為陽性都會誘導甲狀腺癌的發生，成為難以根治的惡性腫瘤，但其在甲狀腺癌的診治及預后中也發揮了輔助價值，有利于為臨床應用BRAF基因突變診斷甲狀腺癌和患者的預后工作提供理論依據，其臨床價值仍需要進一步研究發展。

參考文獻

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