脯氨酰寡肽酶抑制劑體外對(duì)肝星狀細(xì)胞凋亡、增殖和肝纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響*

周達(dá)，王晶，李冰航，孫超，陳源文，范建高

脯氨酰寡肽酶（prolyloligopeptidase，POP，EC 3.4.21.26）是一種能特異性水解不多于30～40個(gè)氨基酸短肽中脯氨酸殘基羧基端肽鍵的絲氨酸蛋白酶，如水解血管緊張素、P物質(zhì)、胸腺素β4等[1]。POP通過(guò)水解酶活性或與其他蛋白間相互作用在體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能，參與多肽的生成與代謝、細(xì)胞增殖與分化、體內(nèi)炎癥與代謝等[2，5]。更為重要的是，與其他組織相比，肝臟內(nèi)POP的活性是最高的，同時(shí)肝內(nèi)還存在如輔酶A這樣能夠調(diào)節(jié)POP活性的內(nèi)源性物質(zhì)，提示其在肝內(nèi)可能具有重要的病理生理功能[4，6，7]。已有研究顯示POP參與肝內(nèi)炎癥及肝細(xì)胞的增殖和分化，肝細(xì)胞內(nèi)POP活力與肝細(xì)胞增殖和分化成熟密切相關(guān)[7-9]，而肝內(nèi)POP活性降低導(dǎo)致的N-乙酰基-絲氨酸-天冬氨酸-賴(lài)氨酸 -脯氨酸（N-acetyl-seryl aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP）生成不足，是肝內(nèi)持續(xù)炎癥反應(yīng)、肝細(xì)胞損傷和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的關(guān)鍵因素[10-13]。肝臟炎癥和纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，至今仍無(wú)有效的治療方法[14]。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，大鼠HSC-T6細(xì)胞系性能穩(wěn)定，可連續(xù)傳代，已被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究[15]。本研究應(yīng)用S17092抑制HSC內(nèi)POP活性，了解POP在HSC生物學(xué)功能發(fā)揮及其對(duì)肝臟炎癥和纖維化發(fā)生相關(guān)基因的影響，以期探索POP在肝臟炎癥和纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠HSC-T6細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，取HSC-T6以適當(dāng)密度接種于不同大小培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為10%FBS/DMEM培養(yǎng)基（血清和培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO，USA），置于含5%CO2孵育箱中，培養(yǎng)細(xì)胞處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)進(jìn)行下列相關(guān)實(shí)驗(yàn)。選擇 S17092（購(gòu)自 Sigma-Aldrich，USA）作為 POP 酶抑制劑[7]。

1.2 細(xì)胞內(nèi)Ac-SDKP檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)，取HSC-T6 細(xì)胞，加入 S17092（0、5、10 μg/ml）共孵育24 h，按試劑盒說(shuō)明書(shū)（購(gòu)自SPI Bio and CEA,France），先使用 RIPA（含 10 μmol/l卡托普利和 1 mmol/l PMSF）裂解細(xì)胞，隨后進(jìn)行HSC內(nèi)Ac-SDKP濃度測(cè)定。通過(guò)各組細(xì)胞數(shù)校正Ac-SDKP終濃度，計(jì)算出每 1×106個(gè)細(xì)胞中 Ac-SDKP的量，以nM/106表示。

1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè) 將HSC-T6（約1×103）接種于96 孔板，與不同濃度的 S17092（0、5、10、25、50、100 μg/ml）共孵育24 h和48 h，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔加入新鮮培養(yǎng)液100μl，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。隨后每孔加入CCK-8試劑10μl，避光37℃孵育 2 h，在酶標(biāo)儀（uQuant，Biotek，USA）測(cè)定每孔450 nm處吸光度（OD值）。計(jì)算48 h每個(gè)濃度下細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，抑制率=（1-處理組吸光度/對(duì)照組吸光度）×100%，所有組別吸光度均先減去空白孔吸光度。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取HSC-T6細(xì)胞，與S17092（0、5、10μg/ml）共孵育24 h，使用不含EDTA的胰酶（購(gòu)自GIBCO，USA）消化提取細(xì)胞。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSC-T6凋亡，具體步驟參照AnnexinVPE/7-AAD凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)（Becton-Dickinson，USA）進(jìn)行。

1.5 基因轉(zhuǎn)錄檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)，取HSC-T6，經(jīng) S17092（0、5、10μg/ml）孵育 24 h，采用Trizol（Takara）法提取RNA，并測(cè)定其濃度和純度。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（primescriptRTmaster mix，Takara），采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法（SYBR Premix Ex Taq，Takara，儀器為Biosystems7500 Real-timePCR system）檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β1（transforminggrowth factor β，TGF-β1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）、Ⅰ型膠原（collagen I，Col I）相關(guān)基因mRNA水平，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，各基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1），其相對(duì)水平（RQ 值）以 2-ΔΔCt表示。

表1 Realtime-PCR引物序列

1.6 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，取HSC-T6，經(jīng) S17092（0、5、10μg/ml）孵育 24 h，使用1 mmol／L的RIPA+PMSF提取細(xì)胞蛋白（購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司），采用BCA法（碧云天生物技術(shù)有限公司）測(cè)定各組蛋白濃度。隨后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉2 h，加各目的蛋白一抗孵育（4℃過(guò)夜），1×TBST洗膜10～15 min×3次，加二抗孵育 1～2 h，1×TBST洗膜 10～15 min×3次，最后使用辣根過(guò)氧化物酶法檢測(cè)（購(gòu)自 Millipore Corporation,Billerica,USA），使用 Image Lab分析蛋白顯影條帶。抗POP、抗TGF-β1、抗α-SMA抗體均購(gòu)自 Sigma-Aldrich公司，抗p-Smad2/3抗體購(gòu)自巴傲得生物科技有限公司，Smad7和PPAR-γ購(gòu)自生工生物工程上海股份有限公司，相關(guān)二抗和Westernblot相關(guān)試劑購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS（Release 8.02 TS Level 02M0,NC,USA）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn),對(duì)方差不齊或非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（IQR）表示，采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖和細(xì)胞內(nèi)Ac-SDKP水平變化 經(jīng)過(guò)不同濃度的S17092抑制POP酶活性后，發(fā)現(xiàn)HSC內(nèi)Ac-SDKP水平較對(duì)照組顯著下降，其中10μg/ml S17092處理后下降約 50%（圖 1A）；50 μg/ml和100 μg/ml S17092對(duì)HSC-T6細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，而與對(duì)照組相比，低濃度組（5、10、25μg/ml） 則能抑制 HSC-T6 增殖 （圖 1B），25μg/ml濃度組作用48 h時(shí)HSC增殖抑制率達(dá)40%（圖 1C）。

圖1 HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

2.2 POP抑制劑對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因水平的影響 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，雖然低濃度S17092（5、10μg/ml）組細(xì)胞凋亡比例較對(duì)照組稍增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A）；HSC-T6經(jīng)過(guò)S17092（5、10μg/ml）處理 24 h 后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞 MCP-1和α-SMA mRNA水平較對(duì)照組明顯升高，MCP-1 mRNA在10μg/ml濃度組較對(duì)照組升高約1.5倍，α-SMA mRNA在10μg/ml處理組較對(duì)照組升高約2倍，各組TGF-β1和Col I基因水平無(wú)顯著性差異（圖2B）。

圖2 HSC-T6細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因變化

2.3 POP抑制劑對(duì)HSC-T6細(xì)胞炎癥和纖維化因子蛋白表達(dá)的影響 HSC-T6經(jīng)過(guò) S17092（5、10μg/ml）處理24 h后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高，10μg/ml處理組較對(duì)照組表達(dá)增加約1.5倍；Smad7和PPAR-γ較對(duì)照組顯著下降，在10μg/ml處理組分別較對(duì)照組下降約50%以上和10%左右，各組細(xì)胞POP、TGF-β1和p-Smad2/3蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（圖3）。

圖3 HSC-T6細(xì)胞炎癥和纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)變化

3 討論

本研究結(jié)果提示POP在HSC細(xì)胞可能具有重要的病理生理功能，并與肝臟炎癥及纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。POP可調(diào)節(jié)HSC分泌炎性因子MCP-1及分泌抗纖維化短肽Ac-SDKP，并通過(guò)調(diào)節(jié)Smad7和PPAR-γ的表達(dá)調(diào)控HSCs內(nèi)TGF-β-Smad信號(hào)通路。

首先，Ac-SDKP為POP水解胸腺素β4（Tβ4）的產(chǎn)物[16]。一方面，POP抑制劑處理組細(xì)胞內(nèi)Ac-SDKP水平顯著下降，提示S17092成功抑制了HSC胞內(nèi)POP酶活性；另一方面，大量研究證實(shí)Ac-SDKP抗機(jī)體實(shí)質(zhì)器官包括心、肝、腎、肺等纖維化作用顯著[10，17-21]。基于此，POP是否通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ac-SDKP水平而發(fā)揮抗肝纖維化作用值得進(jìn)一步探討和驗(yàn)證。我們課題組在前期研究工作中已闡明Ac-SDKP在對(duì)抗四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化及對(duì)抗膽總管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化發(fā)病過(guò)程中作用顯著[10，17]。前期研究結(jié)果顯示Ac-SDKP可以抑制肝內(nèi)TGF-β1及Smad2表達(dá)，而對(duì)Smad7無(wú)顯著影響，可通過(guò)直接調(diào)節(jié)TGF-β1-p-Smad2/3通路抑制肝纖維化。本研究的靶標(biāo)為POP，通過(guò)直接干預(yù)POP酶活性，發(fā)現(xiàn)HSC-T6細(xì)胞內(nèi)TGF-β1-p-Samd2/3通路蛋白未發(fā)生顯著變化，而Smad7表達(dá)卻顯著降低。Smad7的主要作用之一為抑制TGF-β1-pamd2/3信號(hào)通路，發(fā)揮抗纖維化作用。綜合上述結(jié)果，提示POP除了酶解作用以外，還存在其他未知功能。已有研究提示POP除了水解酶功能外，還存在非酶功能，如可與其他蛋白相互結(jié)合，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[22，23]。Tenorio-Laranga J et al[4]通過(guò)對(duì)大鼠體內(nèi)POP進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間抑制，發(fā)現(xiàn)抑制組大鼠肝內(nèi)提取的肽成分與對(duì)照組大鼠相比顯著不同，這些改變的肽大部分源自線(xiàn)粒體，其功能主要是參與蛋白翻譯。因此，以POP為靶向的干預(yù)對(duì)肝纖維化的調(diào)控可能并不依賴(lài)于抗纖維化短肽Ac-SDKP。

其次，本研究發(fā)現(xiàn)POP被抑制時(shí)，HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)亦被抑制，即POP調(diào)控HSC-T6的增殖生長(zhǎng)，可能與肝內(nèi)POP除了存在于胞質(zhì)外，還定位于胞核有關(guān)。核內(nèi)POP可能參與核轉(zhuǎn)運(yùn)和順?lè)串悩?gòu)酶的調(diào)節(jié)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖[24]。我們既往的研究提示Ac-SDKP同樣可抑制HSCs增殖[10]，與本研究結(jié)果相反，從側(cè)面反映POP這種直接調(diào)控細(xì)胞增殖作用與Ac-SDKP無(wú)明顯關(guān)系，更多的是通過(guò)其胞內(nèi)非酶作用調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄所致。近年針對(duì)腫瘤細(xì)胞研究顯示POP抑制劑阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)通過(guò)減少pRb和Ki-67蛋白的表達(dá)而增加p53、p27kip1和pRb2/p130 的表達(dá)[3，25]。因此，POP 抑制劑調(diào)控 HSCs增殖的具體機(jī)制還值得進(jìn)一步探索。

肝纖維化主要表現(xiàn)為肝內(nèi)炎癥及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，HSCs起著至關(guān)重要的作用[26]。我們的研究結(jié)果顯示，當(dāng)HSCs胞內(nèi)POP活性被抑制時(shí)可以引起α-SMA和MCP-1表達(dá)增高及PPAR-γ下調(diào)。α-SMA為活化HSC的標(biāo)志蛋白，MCP-1為HSC分泌的主要促炎促纖維化的因子[27]，同時(shí)PPAR-γ為HSCs處于非活化狀態(tài)即靜止儲(chǔ)脂狀態(tài)的標(biāo)志蛋白，PPAR-γ還可以抑制HSCs的活化[28，29]。上述這些關(guān)鍵蛋白表達(dá)的變化提示當(dāng)HSCs內(nèi)POP被抑制時(shí)可以促進(jìn)其致纖維化作用，這一效應(yīng)是由于POP水解活性降低導(dǎo)致其下游產(chǎn)物Ac-SDKP減少所致，還是POP自身通過(guò)蛋白-蛋白相互作用所致，仍有待進(jìn)一步探索，但不管何種機(jī)制，都說(shuō)明POP或其下游產(chǎn)物Ac-SDKP均可抑制HSCs活性而有助于減輕肝纖維化[30]。

總之，POP在肝內(nèi)的具體功能尚不清楚，尤其是POP自身與其下游產(chǎn)物Ac-SDKP的生物學(xué)效應(yīng)和POP的非酶解功能還需要研究[31]。同時(shí)，尚需進(jìn)一步行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以POP為靶向的干預(yù)有無(wú)改善纖維化的作用。但總得來(lái)說(shuō)，本研究通過(guò)POP抑制劑初步揭示了POP這一蛋白酶對(duì)HSCs的調(diào)節(jié)作用，其在抗肝纖維化方面的作用值得進(jìn)一步探討。

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