選擇性β3腎上腺素能受體激動劑對非酒精性脂肪性肝病大鼠血清氧化應激指標和肝組織纖維化的影響

王新偉，呂柯，孫曉，張菊

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是臨床較為常見的慢性肝病，以肝細胞彌漫性大泡性脂肪變性和脂肪儲積為主要特征的臨床綜合征，可進展為脂肪性肝纖維化、肝硬化以及終末期肝衰竭[1]。目前，NAFLD發病機制尚不明確。近年來，有研究發現，β3腎上腺素能受體（β3-adrenergic receptor，β3-AR）能與其特異性配體結合，參與機體脂質代謝和體質量控制等多種生理效應。β3-AR功能障礙可能導致多種生理效應的異常，如脂質代謝異常、肥胖、胰島素抵抗等[2-4]，可能參與了NAFLD的發病過程。本研究采用高脂飲食建立大鼠NAFLD模型，觀察了β3-AR激動劑干預對動物血脂、肝功能、氧化應激和肝纖維化指標的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑與儀器 無特定病原體（sprcific pathogen free，SPF）級健康雄性SD大鼠30只，體質量（200±20）g，飼養溫度（22±3）℃，濕度為60%～80%。高脂飼料（42%脂肪+17%蛋白質+41%碳水化合物）購自上海斯萊克實驗動物研究有限公司；普通飼料（14%脂肪+24%蛋白質+62%碳水化合物）由重慶醫科大學實驗動物中心提供；β3-AR激動劑（BRL 37344）購自美國Sigma公司；檢測大鼠透明質酸（hyaluronic acid，HA）的ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，檢測轉化生長因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的ELISA試劑盒購自美國R＆D公司；檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase-Px，GSH-Px）試劑盒購自南京建成生物科技研究所；AU5800全自動生化分析儀為美國貝克曼公司產品。

1.2 動物NAFLD模型的建立 將30只大鼠隨機分為對照組（NC）組、高脂模型組（HC組）和β3-AR激動劑干預組（BRL組），每組10只。在NC組，給予普通飼料喂養14 w，第8 w末時，給予0.9%氯化鈉溶液4 nmol·kg-1尾靜脈注射；在HC組，給予高脂飼料喂養14 w，第8 w末時給予0.9%氯化鈉溶液4 nmol·kg-1尾靜脈注射；在BRL組，給予高脂飼料喂養14 w，第8 w末時給予BRL-37344 4 nmol·kg-1尾靜脈注射。3組均2次/w注射，持續用藥6 w。在14 w末，大鼠隔夜禁食12 h，3%戊巴比妥鈉麻醉，采用斷頭法處死所有動物，迅速按常規采血8～10 mL，3000 r/m離心10 min，分離上層血清，并轉移入新的EP管中，-80℃低溫下保存。采血后，迅速摘除肝臟稱質量，-80℃低溫下保存。將低溫保存的肝組織于4℃冰箱解凍，測定。

1.3 檢測方法 取血清，室溫解凍，使用全自動生化分析儀檢測血清甘油三酯（triglycerid，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate transaminase，AST）和丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）；采用 ELISA 法檢測血清HA和TGF-β1）。精確稱取肝組織200 mg，勻漿，冰浴條件下2000 r/m離心3～5 min，制備10%肝組織勻漿。使用分光光度計測定肝組織勻漿SOD、MAD 和 GSH-Px。

1.4 肝組織病理學檢查 將固定后的肝組織進行石蠟包埋、切片，分別行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色，在光鏡下觀察非酒精性脂肪性肝病活動積分（NAFLD activity，NAS）和肝纖維化分期。NAS評分包括肝細胞脂肪變性（＜5%為0分，5%～33%為1分，34%～66%為2分，＞66%為3分）、炎性浸潤（20倍光鏡下計算壞死病灶，無為0分，＜2個為1分，2～4個為2分，＞4個為3分）和氣球樣變（無為0分，少見為1分，多見為2分）；肝纖維化分期標準：無為0分，少量門脈區纖維化，有或無細胞間隔纖維化為1分，大量門脈區纖維化，有或無細胞間隔纖維化為2分，大量門脈區纖維化伴隨少量的不典型橋接纖維化為3分，大量的門脈區纖維化伴有顯著的橋接纖維化為4分，顯著的橋接纖維化，有或無不典型的假小葉為5分，高度可疑或診斷為肝硬化為6分。

1.5 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，分析前先檢驗數據是否服從正態分布。對符合正態分布的數據以±s表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LDS-t檢驗；對非正態分布的數據采用非參數檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠血清生物化學指標比較 HC組和BRL 組血清 TC、TG、ALT、AST、HA 和 TGF-β1 顯著高于對照組（P＜0.05），而BRL組上述指標顯著高于 HC 組（P＜0.05，表1）。

表1 各組大鼠血生物化學指標（±s）比較

表1 各組大鼠血生物化學指標（±s）比較

與NC組比，①P＜0.05；與HC組比，②P＜0.05

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2.2 三組大鼠肝組織SOD、MDA和GSH-Px水平比較 HC組和BRL組肝組織SOD和GSH-Px水平顯著低于，而MDA水平顯著高于HC組（P＜0.05）；BRL組肝組織SOD和GSH-Px水平顯著低于，而MDA水平顯著高于HC組，差異有統計學意義（P＜0.05，表2）。

表2 三組大鼠肝組織SOD、MDA和GSH-Px 水平（±s）比較

表2 三組大鼠肝組織SOD、MDA和GSH-Px 水平（±s）比較

與NC組比，①P＜0.05；與HC組比，②P＜0.05

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2.3 三組大鼠肝組織病理學變化情況的比較 HC組和BRL組肝組織脂肪變性、炎性浸潤、氣球樣變和纖維化評分均顯著高于NC組（P＜0.05），而BRL組上述指標顯著高于HC組，差異有統計學意義（P＜0.05，表3、圖 1、圖 2）。

表3 三組大鼠肝組織病理學評分（±s）比較

表3 三組大鼠肝組織病理學評分（±s）比較

與NC組比，①P＜0.05；與HC組比，②P＜0.05

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圖1 肝組織病理學表現（HE，100×）

圖2 肝組織病理學表現（Masson，100×）

3 討論

肝纖維化是慢性肝病發展的共同途徑，以細胞外基質（extracellular matrix，ECM）蛋白沉積為特征，伴隨肝臟功能和結構的異常，繼續發展可誘發肝硬化或肝癌[5，6]。

目前，NAFLD發病機制尚不明確，以“二次打擊”學說占主導地位，即胰島素抵抗、氧化應激反應和異常的細胞因子參與的炎癥反應為核心的二次打擊導致肝臟發生炎癥壞死、肝纖維化[9，10]。在NAFLD發生后，肝細胞內過剩的游離脂肪酸（free fatty acids，FFAs）發生脂質過氧化反應，誘導活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）大量產生，導致脂質過氧化損傷。既往研究報道，肝細胞損傷時ROS含量明顯升高[11]。ROS含量增多可導致機體內多聚不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，并形成脂質過氧化物（lipid peroxide，LPO），LPO可通過炎性細胞浸潤激活肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSCs），引發肝纖維化，啟動TGF-β1、轉錄因子轉錄，加重機體炎性反應，增加纖維細胞生成。有研究報道，TGF-β1可促使HSCs活化，是肝纖維化的始動因子[12，13]。SOD和GSH-Px可清除機體內多余的氧自由基，而MDA是脂質過氧化產物的典型代表，其水平可代表機體細胞受氧自由基攻擊的程度[14]。

β3-AR為一種G蛋白偶聯的膜表面受體，具有調節脂肪分解和消耗的作用。近年來，有研究表明，β3-AR與胰島素抵抗和肥胖密切相關[15，16]，還有研究指出，β3-AR異?？赡軐е轮|過氧化反應[17-19]。國內研究報道，兒茶酚胺可通過β3-AR與鳥嘌呤核苷酸和腺苷酸環化酶等作用，刺激細胞脂肪氧化分解，抑制肝臟脂肪合成，控制NAFLD進展[19，20]。因此，考慮β3-AR可能參與了NAFLD發生過程。鑒于此，我們觀察了β3-AR受體激動劑對NAFLD大鼠肝臟氧化應激及血清肝纖維化指標的影響，結果發現，HC組在BRL-373干預后，氧化應激反應及肝纖維化程度加劇，提示AR-β3激動劑可能加重NAFLD肝纖維化形成。

【參考文獻】

[1]Younossi ZM，Koenig AB，Abdelatif D，et al.Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence，incidence，and outcomes.Hepatology，2016，64（1）:73.

[2]Cypess AM，Weiner LS，Robertstoler C，et al.Activation of human brown adipose tissue by a β3-Adrenergic receptor agonist.Cell Metab，2015，21（1）:33-38.

[3]Kleindienst A，Battault S，Belaidi E，et al.Exercise does not activate the β3 adrenergic receptor-eNOS pathway，but reduces inducible NOS expression to protect the heart of obese diabetic mice.Basic Res Cardiol NLM，2016，111（4）:1-12.

[4]Giuseppe P，Monica C，Serena M，et al. β3 adrenergic receptor in the kidney may be a new player in sympathetic regulation of renal function.Kidney Int，2016，90（3）:555-567.

[5]Sitanggang EJ，Antarianto RD，Swa J，et al.Bone marrow stem cellsanti-liverfibrosispotency:inhibition ofhepatic stellate cells activity and extracellular matrix deposition.Int J Stem Cells，2017，10（1）:69.

[6]Andrea B，Claudia M，Alice C，et al.Extracellular matrix molecular remodeling in human liver fibrosis evolution.Plos One，2016，11（3）:e0151736.

[7]邢英，李雅麗，鄭嶸炅，等.利拉魯肽對非酒精性脂肪肝大鼠胰島素抵抗的改善作用.實用肝臟病雜志，2017，20（6）:668-671.

[8]Ragab S M M，Elghaffar S K A，El-Metwally T H，et al.Effect of a high fat，high sucrose diet on the promotion of non-alcoholic fatty liver disease in male rats:the ameliorative role of three natural compounds.Lipids Health Dis，2015，14（1）:83.

[9]Patil R，Sood G K.Non-alcoholic fatty liver disease and cardiovascular risk.World J Gastrointest Pathophysiol，2017，149（2）:51-58.

[10]Buzzetti E，Pinzani M，Tsochatzis E A.The multiple-hit pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）.Metabolism，2016，65（8）:1038.

[11]Cahova M，Palenickova E，Dankova H，et al.Metformin prevents ischemia reperfusion-induced oxidative stress in the fatty liver byattenuation ofreactive oxygen speciesformation.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2015，309（2）:G100.

[12]Bruckbauer A，Banerjee J，Fu L，et al.A Combination of leucine，metformin，and sildenafil treats nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis in mice.Int J Hepatol，2016，2016（5）:1-16.

[13]Inoue A，Obayashi K，Sonoda Y，et al.Regulation of matrix metalloproteinase-1 and alpha-smooth muscle actin expression by interleukin-1 alpha and tumour necrosis factor alpha in hepatic stellate cells.Cytotechnology，2016，69（3）:461-468.

[14]Bostwick D G，Alexander E E，Singh R，et al.Antioxidant enzyme expression and reactive oxygen species damage in prostatic intraepithelial neoplasia and cancer.Cancer，2015，89（1）:123-134.

[15]Ishino S，Sugita T，Kondo Y，etal.Glucose uptake ofthe muscle and adipose tissues in diabetes and obesity disease models:evaluation of insulin and β3-adrenergic receptor agonist effects by 18 F-FDG.Ann Nuck Med，2017，31（5）:413-423.

[15]Burguete-Garcia AI，Martinez-Nava GA，Valladares-Salgado A，et al.Association ofβ1 and β3 adrenergic receptors gene polymorphisms with insulin resistance and high lipid profiles related to type 2 diabetes and metabolic syndrome.Nutr Hosp，2014，29（6）:1327-1334.

[16]Kitade H，Chen G，Ni Y，et al.Nonalcoholic fatty liver disease and insulin resistance:New insights and potential new treatments.Nutrients，2017，9（4）:387.

[17]劉莉，葉鵬.激活β-3腎上腺素能受體恢復一氧化氮/氧化還原平衡，增強高血糖患者的內皮功能.中華高血壓雜志，2016，32（3）:256-256.

[18]張源，王麗，張慧，等.β3腎上腺素能受體對心肌成纖維細胞纖維化的作用及其機制.中華心血管病雜志，2016，44（6）:501-507.

[19]Christie G，Roisin K L，Asfree G，et al.Lack of cardioprotection by single-dose magnesium prophylaxis on isoprenaline-induced myocardial infarction in adult Wistar rats.Cardiovasc J Afr，2015，26（6）:242-249.

[20]張源，王麗，張慧，等.β3腎上腺素能受體對心肌成纖維細胞纖維化的作用及其機制.中華心血管病雜志，2016，44（6）:501-507.