肝臟前體細(xì)胞移植對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)大鼠肝組織學(xué)的影響*

陳 輝，任萬(wàn)雷，楊愛(ài)婷

肝臟前體細(xì)胞（hepatic progenitor cells，HPCs），或稱肝內(nèi)干細(xì)胞（在嚙齒類動(dòng)物，稱卵圓細(xì)胞），是肝臟損傷時(shí)一類重要的修復(fù)細(xì)胞[1-4]。HPCs有別于成熟的肝細(xì)胞，位于肝內(nèi)膽管系統(tǒng)的終末支Hering管，具有多分化潛能、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低等特點(diǎn)[5-11]。本研究在CCl4誘導(dǎo)的自發(fā)逆轉(zhuǎn)肝纖維化小鼠，將HPCs經(jīng)脾靜脈移植，觀察了肝組織學(xué)的變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞與試劑 SPF/VAF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量180～200 g，分籠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，溫度20℃～25℃，相對(duì)濕度40%～70%。用桿狀飼料喂養(yǎng)，去離子水裝入水瓶，供動(dòng)物自由飲用。實(shí)驗(yàn)在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院動(dòng)物室進(jìn)行。大鼠肝臟前體細(xì)胞系WB-F344由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院裴雪濤教授惠贈(zèng)。DMEM高糖培養(yǎng)基粉末、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。兔抗大鼠OV6抗體購(gòu)自美國(guó)RD公司，兔抗大鼠α-SMA購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，小鼠抗大鼠TIMP-1購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。檢測(cè)大鼠血清Ⅰ型膠原的ELISA試劑盒購(gòu)自北京藍(lán)鯨公司。檢測(cè)大鼠白蛋白的ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 肝纖維化大鼠模型的制備 將24只大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1 w，將其隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為0 w（對(duì)照組）和模型組（4 w、8 w、12 w）。將 20%CCl4溶于橄欖油，給予0.2 ml.100 g-1體質(zhì)量腹腔注射，2次/w，連續(xù)12 w，分別于0 w、4 w和12 w末處死大鼠，取肝組織，每塊約1×1×0.5 cm，置于10%中性甲醛中固定。

1.3 前體細(xì)胞脾內(nèi)移植 取WB-F344細(xì)胞，經(jīng)復(fù)蘇，接種于含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，用0.25%胰酶消化、傳代。取14只大鼠，給予CCl4腹腔注射，劑量、方法同1.2，連續(xù)4 w。在造模成功后，將模型大鼠隨機(jī)分為自發(fā)逆轉(zhuǎn)組（n=7）和 HPCs移植組（n=7）。在HPCs移植組，經(jīng)脾注射HPCs懸液0.5 ml（5×106個(gè)HPCs），在自發(fā)逆轉(zhuǎn)組，給予等體積PBS脾內(nèi)注射。術(shù)前，給予大鼠苯巴比妥鈉（0.1 ml·100g-1）腹腔注射，行全身麻醉，皮膚消毒，沿腹正中線逐層切開(kāi)腹部皮膚和肌肉，長(zhǎng)約2 cm，打開(kāi)腹腔。用棉簽托出脾臟，吸取細(xì)胞懸液，用30G針頭沿縱軸刺入脾臟，一邊緩慢回抽，一邊注射PBS或細(xì)胞懸液0.5 ml，見(jiàn)脾臟輕度漲大。輕壓穿刺口，待無(wú)滲血后，將脾回納。給予100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素1 ml沖洗腹腔，預(yù)防感染。關(guān)腹。在脾內(nèi)注射4 w后，經(jīng)心臟取血，留取血清，置于-80℃冰箱保存。取肝組織，置于液氮中快速冷凍，置于-80℃冰箱中保存。

1.4 肝組織OV6和α-SMA檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法，將肝組織切片經(jīng)60℃烘烤，二甲苯、乙醇脫蠟復(fù)水，0.01%枸櫞酸鈉緩沖液高壓修復(fù)2 min，自然冷卻，滴加3%過(guò)氧化氫溶液，37℃孵育15 min，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，分別滴加兔抗OV6多克隆抗體（工作濃度1:100）、兔抗α-SMA多克隆抗體（工作濃度1:100），4℃過(guò)夜，滴加即用型Maxvision試劑（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），室溫15 min，DAB（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）顯色2～5 min，蘇木素復(fù)染30 s，脫水、透明、封片。在光鏡下觀察、攝片。同時(shí)，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，采用Image-Pro-Plus6.0圖像分析軟件測(cè)定細(xì)胞染色陽(yáng)性比例。

1.5 肝組織α-SMA和TIMP-1表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，取肝組織20 mg，加蛋白裂解液1 ml，4℃研磨成勻漿，經(jīng)離心分離制備蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒定量，每組取總蛋白20 μg上樣，12%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)恒流300 mA 70 min，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入抗α-SMA（1:1000）和抗 TIMP-1（1:1000），4℃孵育過(guò)夜，充分洗滌，分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔（1：9 000）、兔抗小鼠第二抗體（1：8 000），室溫孵育 1 h，充分洗滌后，發(fā)光、顯影、定影、曝光、掃描，以α-肌動(dòng)蛋白（α-actin）為內(nèi)參照。α-actin用洗膜液（42℃，30 min）洗膜，重新封閉、先后加入一抗（1：4000稀釋）、二抗孵育。用掃描儀將硝酸纖維素膜上的蛋白條帶掃描至計(jì)算機(jī)，應(yīng)用Gel Pro Analyzer software 4.0軟件分析目的蛋白條帶的灰度值。目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)值。

1.6 血清檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)Ⅰ型膠原水平；常規(guī)檢測(cè)ALT和ALB。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝組織α-SMA和OV-6表達(dá)情況 正常肝組織α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞，有少量OV6表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞位于膽管附近；在模型組肝組織壞死區(qū)周?chē)写罅喀?SMA表達(dá)陽(yáng)性的HSCs（即活化的HSC），在匯管區(qū)周?chē)写罅縊V6表達(dá)陽(yáng)性的HPCs。隨纖維化程度增加，α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，在CCl4腹腔注射 0 w、4 w、8 w和 12 w，α-SMA陽(yáng)性率分別為（2.1±0.3）% 、（15.4±4.4）% 、（30.1±4.1）% 、（44.1±7.2）%（P＜0.05），OV6陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量隨造模時(shí)間逐漸升高而后下降，OV6陽(yáng)性率分別為（2.2±0.30）%、（10.3±1.4）% 、（2 5.5±5.1）% 、（12.6±2.2）%（P＜0.05，圖 1）。

2.2 大鼠肝組織病理學(xué)變化 自發(fā)逆轉(zhuǎn)組肝組織有炎細(xì)胞浸潤(rùn)伴假小葉形成，HPCs移植組可見(jiàn)纖維間隔變細(xì)，膠原纖維自匯管區(qū)或中央靜脈延伸明顯，未包繞整個(gè)肝小葉；天狼猩紅染色發(fā)現(xiàn)，與自發(fā)逆轉(zhuǎn)組比，脾內(nèi)HPCs移植組肝纖維化程度減輕，膠原面積縮小，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

2.3 大鼠肝組織和血清與纖維化相關(guān)指標(biāo)變化 自發(fā)逆轉(zhuǎn)組肝組織α-SMA和TIMP-1蛋白水平顯著高于HPCs移植組；自發(fā)逆轉(zhuǎn)組血清I型膠原水平顯著高于 HPCs移植組（P＜0.05，圖 3）。

2.4 大鼠肝功能指標(biāo)的變化 自發(fā)逆轉(zhuǎn)組血清ALT水平顯著高于HPCs移植組，白蛋白水平顯著低于HPCs移植組，表明細(xì)胞移植不僅能夠減輕CCl4造成的肝損傷，而且能夠改善肝功能。

3 討論

盡管胚胎干細(xì)胞或骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞有治療纖維化的潛能，但相比之下，肝臟前體細(xì)胞的肝臟定向性更強(qiáng)，更容易分化成肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞，是更為理想的治療肝臟疾病的候選細(xì)胞[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化時(shí)，干細(xì)胞表現(xiàn)出類間質(zhì)細(xì)胞樣的特性，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物表達(dá)減少，而間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物表達(dá)增加，同時(shí)分泌的細(xì)胞外基質(zhì)也增加，最終加重肝纖維化的進(jìn)展[15，16]。我們既往的研究也發(fā)現(xiàn)TGFβ1能促前體細(xì)胞分化成類間質(zhì)樣細(xì)胞，表現(xiàn)為αSMA表達(dá)增加，膠原分泌增加，前體細(xì)胞失去特有的極性或錨定依賴性等特點(diǎn)，進(jìn)而獲得間質(zhì)細(xì)胞表型、細(xì)胞遷移和合成細(xì)胞外基質(zhì)等間質(zhì)細(xì)胞的功能[17]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，前體細(xì)胞暴露于TGFβ1的不同時(shí)間可能影響其對(duì)肝纖維化的作用[18]。

圖1 兩組肝組織α-SMA和OV6表達(dá)（200×）和陽(yáng)性細(xì)胞百分比 OV6陽(yáng)性的HPCs數(shù)量在CCl4處理8 w時(shí)達(dá)高峰，α-SMA陽(yáng)性的HSCs數(shù)量隨纖維化程度增加而增加

圖2 兩組肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（A、B為HE染色，C、D為天狼星紅染色，100×） 與自發(fā)逆轉(zhuǎn)組比，HPCs移植后肝纖維化程度減輕，膠原面積減少

對(duì)大鼠和人肝纖維化的研究均發(fā)現(xiàn)前體細(xì)胞與星狀細(xì)胞關(guān)系密切。利用大鼠2-AAF/PH及乙酰氨基酚經(jīng)典誘導(dǎo)前體細(xì)胞激活，發(fā)現(xiàn)在星狀細(xì)胞活化過(guò)程中伴隨前體細(xì)胞增殖，活化的星狀細(xì)胞與卵圓細(xì)胞均位于匯管區(qū)，且位置毗鄰，隨造模時(shí)間延長(zhǎng)逐步向小葉內(nèi)遷移。Lorenzini et al[19]發(fā)現(xiàn)在慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎患者肝纖維化組織和肝臟受損大鼠/小鼠，激活的肝臟前體細(xì)胞常與肝星狀細(xì)胞伴行，我們既往的研究不但發(fā)現(xiàn)在肝纖維化大鼠，前體細(xì)胞位于增生的星狀細(xì)胞周?chē)野l(fā)現(xiàn)前體細(xì)胞的變化與星狀細(xì)胞的活化及消長(zhǎng)有密切關(guān)系。因此，我們推測(cè)肝纖維化逆轉(zhuǎn)大鼠在接受HPCs移植后，加速了肝纖維化的逆轉(zhuǎn)，可能與其抑制了HSCs的活化有關(guān)。

圖3 兩組與纖維化相關(guān)的指標(biāo)變化

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