腺病毒介導(dǎo)的RNA干擾ERCC1基因表達(dá)對卵巢癌順鉑化療的增敏作用

田麗娜，瞿全新，盛曉濱，徐福強(qiáng)

卵巢癌在所有婦科腫瘤中發(fā)病率最高，危害較大。順鉑是卵巢癌化療的一線藥物，在卵巢癌綜合治療中占有重要地位。目前普遍認(rèn)為，DNA損傷是癌癥發(fā)病的重要機(jī)制，順鉑細(xì)胞毒作用主要是形成鉑-DNA加合物，ERCCl基因是DNA損傷修復(fù)途徑的關(guān)鍵基因，其表達(dá)升高與卵巢癌順鉑耐藥的發(fā)生密切相關(guān)。RNA干擾能夠作為一種簡單、有效地代替基因敲除的遺傳工具，哺乳動物中起作用的是小干擾RNA(siRNA)，在卵巢癌細(xì)胞中成功調(diào)控ERCC1基因表達(dá)，hTERT啟動子作為腫瘤特異性啟動子已經(jīng)被廣泛用于靶向轉(zhuǎn)錄基因治療研究中，本實(shí)驗(yàn)采用5型腺病毒基因重組而成的腺病毒載體，通過RNA干擾技術(shù)阻斷ERCC1基因的表達(dá)來增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的DDP敏感性，為基因治療克服卵巢癌耐藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系 人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞株SKOV3，由天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)試驗(yàn)室提供。

1.1.2 相關(guān)試劑及耗材 注射用順鉑(凍干型)：齊魯制藥廠(批號H20023461)。重組腺病毒：Ad-hTERT-ERCCl-siRNA及只包含ERCC1啟動子的重組腺病毒Ad-hTERT由本研究小組前期合成[1]。RPMI-1640培養(yǎng)基：天津圣東生物科技發(fā)展公司(批號BW12014)。小牛血清：中美合資蘭州民海生物工程有限公司(批號200110203)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件 卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞用含10%牛血清的RPMIl640培養(yǎng)液培養(yǎng)，在37 ℃、5%CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞為貼壁生長細(xì)胞，按1∶2或1∶3傳代。

1.2.2 藥物配置 順鉑用生理鹽水配成1 mg/ml的貯存液，腺病毒置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 臺盼藍(lán)排斥試驗(yàn) 取2×104/ml的SKOV3細(xì)胞接種于24孔板，每孔l ml，根據(jù)臺酚藍(lán)試劑盒染色操作方法，每隔24 h染色3個(gè)孔內(nèi)細(xì)胞，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù), 求平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d，繪制細(xì)胞生長曲線。根據(jù)阮和云等[2]的實(shí)驗(yàn)方法計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。

1.2.4 MTT法測定SKOV3細(xì)胞順鉑IC50值 實(shí)驗(yàn)組取對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞，經(jīng)消化后以4.4×104/ml的細(xì)胞濃度加入到96孔板中，每孔180 pl。培養(yǎng)24 h后，順鉑(DDP)等比稀釋后分別加入96孔板中，分為6個(gè)濃度，其終濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 μg/ml。每一濃度設(shè)4個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)立陰性對照組(只含等體積細(xì)胞懸液，不加藥物)、空白調(diào)零孔(只含等體積完全培養(yǎng)基，不加藥物)。培養(yǎng)72 h后，MTT法測573 nm處OD值。順鉑對SKOV3細(xì)胞的抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD-空白調(diào)理組OD)/(陰性對照組OD-空白調(diào)零組OD)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，取平均值。根據(jù)劉國艷等[3, 4]的方法計(jì)算IC50。

1.2.5 MTT法測定不同感染復(fù)數(shù)的腺病毒對SKOV3細(xì)胞的影響 實(shí)驗(yàn)組取對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞，經(jīng)消化后以8×104/ml的細(xì)胞濃度加入到96孔板中，每孔100 μl。培養(yǎng)24 h后，分別用0、1、10、20、30、40、50、60、70感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)的重組腺病毒感染細(xì)胞，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)陰性對照組按照上述方法加入腺病毒(Ad-hTERT)。培養(yǎng)2 d后，MTT法測573 nm處OD值。腺病毒對SKOV3細(xì)胞生長的抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/MOI 0組OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，取平均值[3, 5]。

1.2.6 MTT法測定不同感染復(fù)數(shù)腺病毒對SKOV3細(xì)胞順鉑IC50值的影響 實(shí)驗(yàn)組取對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞，經(jīng)消化后以8×104/ml濃度加入到96孔板中，每孔100 μl。培養(yǎng)24 h后，分別用l、10、50、80感染復(fù)數(shù)的重組腺病毒感染細(xì)胞，每孔180 μl。同時(shí)陰性對照組(只含等體積細(xì)胞懸液，不加藥物)、空白調(diào)零孔(只含等體積完全培養(yǎng)基，不加藥物)。每組設(shè)24個(gè)復(fù)孔。12 h后，每組細(xì)胞分別加入不同濃度DDP，每組最終設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72 h，計(jì)算不同感染復(fù)數(shù)腺病毒作用下SKOV3順鉑IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，取平均值。

1.2.7 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 取1×105/ml濃度、對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞，每孔500 μl接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，分別用1、10、50、80感染復(fù)數(shù)的腺病毒感染細(xì)胞，同時(shí)陰性對照組(只含等體積細(xì)胞懸液，不加病毒)。每一感染復(fù)數(shù)設(shè)2個(gè)復(fù)孔，分為2組。培養(yǎng)4 h后，其中一組細(xì)胞加入順鉑，調(diào)整終濃度為4 μg/ml，培養(yǎng)24 h后，按照Hoechst試劑盒方法固定染色[5]，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.2.8 流式細(xì)胞技術(shù)測定DDP及不同濃度腺病毒作用的細(xì)胞周期與凋亡 將生長良好的SKOV3細(xì)胞，以1.6×105/ml濃度6 ml傳代至新培養(yǎng)瓶中，共11瓶，培養(yǎng)24 h后，加入治療藥物，分組方法為：(1)Ad-HTERT-ERCCl-siRNA組，添加重組腺病毒MOI 0、1、10、50、80；(2)病毒聯(lián)合順鉑組，在(1)的基礎(chǔ)上添加終濃度為4 μg/ml的順鉑；(3)空載體病毒(Ad-HTERT)聯(lián)合順鉑組，在順鉑終濃度為4 μg/ml的基礎(chǔ)上添加空載體病毒MOI 50。以上各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后終止，收集細(xì)胞處理后，按流式細(xì)胞試劑盒操作方法，測定細(xì)胞凋亡和周期分布[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，生長曲線圖采用折線圖方法繪制，回歸方程及IC50值采用回歸分析計(jì)算，均數(shù)比較采用單因素方差分析。順鉑濃度與抑制率關(guān)系及腺病毒濃度與細(xì)胞對順鉑的敏感性關(guān)系采用相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SKOV3細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)前5 d逐漸增多，5 d后趨于平緩(圖1)。

圖1 SKOV3細(xì)胞生長曲線及形態(tài)

A.對數(shù)生長期細(xì)胞生長曲線;B.SKOV3細(xì)胞對數(shù)生長期形態(tài)(臺酚藍(lán)，×400)

2.2 順鉑和腺病毒對SKOV3細(xì)胞的影響 SKOV3細(xì)胞給予順鉑處理后，隨著順鉑濃度的增加，SKOV3細(xì)胞的存活數(shù)量進(jìn)行性下降，細(xì)胞抑制率逐漸升高，順鉑濃度與SKOV3細(xì)胞抑制率呈線性正相關(guān)(圖2，A)，相關(guān)系數(shù)r=0.9905(P<0.05)，順鉑IC50值為(7.76±0.37)μg/ml。而SKOV3細(xì)胞給予腺病毒處理后，對照組(Ad-HTERT)SKOV3細(xì)胞的存活數(shù)量無明顯改變。而實(shí)驗(yàn)組中，隨著感染復(fù)數(shù)的逐漸增加，SKOV3細(xì)胞的存活數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞抑制率逐漸升高(圖2，B)，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖2 順鉑和腺病毒對SKOV3細(xì)胞的影響

A.順鉑對SKOV3細(xì)胞的抑制率;B.對照組與試驗(yàn)組對SKOV3細(xì)胞抑制率

2.3 腺病毒對SKOV3細(xì)胞順鉑敏感性的影響 對照組中SKOV3在感染了空載體腺病毒(Ad-HTERT)后，IC50無明顯變化(圖3A)。對順鉑的敏感性無明顯增加(圖3B)。實(shí)驗(yàn)組中SKOV3細(xì)胞在感染了抑制ERCCl基因表達(dá)的腺病毒后，IC50進(jìn)行性下降，并且呈濃度相關(guān)性(r=0.9943，P<0.05)(圖3A)。SKOV3細(xì)胞對順鉑的敏感性隨病毒濃度的增加而增加，分別增加了9.4%(t=5.060，P<0.05)、16.4%(t=10.763，P<0.05)、23.2%(t=23.175，P<0.05)、33.5%(t=16.809，P<0.05)(圖3B)。

圖3 腺病毒對SKOV3細(xì)胞順鉑敏感性的影響

A.兩組病毒感染SKOV3細(xì)胞后DDP的IC50變化；B.對照組與試驗(yàn)組對SKOV3 DDP敏感性的影響

2.4 細(xì)胞凋亡和周期測定 本實(shí)驗(yàn)測得SKOV3細(xì)胞G1、S和G2/M期細(xì)胞分別為28.12%、58.02%和13.87%，凋亡率為15.34%(圖4和圖5A)。

對于SKOV3細(xì)胞，不同感染復(fù)數(shù)的Ad-HTERT-ERCCl-siRNA感染SKOV3細(xì)胞后，細(xì)胞周期左移，G1期比例增加，S期比例減少，G2/M期比例減少，細(xì)胞凋亡率有所增高(圖4、5)。

單純順鉑作用組的細(xì)胞周期明顯右移，G1期細(xì)胞比例減少, S期細(xì)胞比例增高，G2/M期比例減少，細(xì)胞凋亡率增高，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。Ad-HTERT-ERCCl-siRNA聯(lián)合順鉑作用下，細(xì)胞周期變化與單純順鉑作用組相似，細(xì)胞凋亡率最高達(dá)對照組的2.66倍(40.76/15.34)，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖4、5)。空載體病毒(Ad-hTERT)聯(lián)合順鉑作用下，與單獨(dú)順鉑治療組相比，細(xì)胞周期分布相近，細(xì)胞凋亡率無明顯改變(圖6)，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖4 單純順鉑作用組與對照組SKOV3細(xì)胞不同細(xì)胞周期比例及凋亡率 A.G1期細(xì)胞比例;B.S期細(xì)胞比例; C.G2/M期細(xì)胞比例; D. 凋亡率

圖5 Ad-HTERT-ERCCl-siRNA聯(lián)合順鉑作用流式細(xì)胞結(jié)果

A.正常SKOV3細(xì)胞;B. 重組腺病毒MOI 1; C. 重組腺病毒MOI 10; D. 重組腺病毒MOI 50; E. 重組腺病毒MOI 80; F.DDP 4 μg; G. DDP 4 μg+重組腺病毒MOI 1; H. DDP 4 μg+重組腺病毒MOI 10; I. DDP 4 μg+重組腺病毒MOI 50; J. DDP 4 μg+重組腺病毒MOI 80

圖6 空載體病毒聯(lián)合順鉑與單獨(dú)順鉑治療組SKOV3細(xì)胞凋亡率

3 討 論

順鉑是一種臨床常用的腫瘤化療藥物，已經(jīng)使用了近30年，可以抑制多種人類腫瘤[7]。順鉑的細(xì)胞毒作用主要是形成鉑-DNA復(fù)合物，鉑-DNA復(fù)合物能阻礙DNA的模板作用，抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致DNA的斷裂和錯誤編碼[8, 9]。順鉑等抗癌藥物引起的DNA損傷主要通過NER途徑修復(fù)，腫瘤細(xì)胞的順鉑敏感性與DNA損傷修復(fù)能力有關(guān)[10]。核苷酸切除修復(fù)是正常的細(xì)胞針對DNA鏈上較大損傷的主要修復(fù)過程，是清除鉑類藥物所致的DNA螺旋扭曲的主要機(jī)制，在NER過程中，鉑類耐藥的最為關(guān)鍵的因子是ERCC1[11]，也是目前研究較多的DNA修復(fù)基因之一。ERCC1位于人類19號染色體上，參與了DNA鏈的切割和損傷識別。體內(nèi)和體外研究表明，ERCC1的mRNA或者蛋白質(zhì)表達(dá)水平的升高于卵巢腫瘤、膀胱腫瘤、消化道腫瘤、乳腺癌及肺癌等多種腫瘤的耐藥性及化療反應(yīng)性密切相關(guān)[12-16]。因此針對DNA損傷修復(fù)途徑采取策略為降低細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力，可以增加腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性[17, 18]。

本試驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)室前期合成的攜帶hTERT啟動子的重組腺病毒載體感染卵巢癌細(xì)胞SKOV3，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明空載體病毒對細(xì)胞生長無明顯抑制作用，而重組腺病毒載體具有抑制細(xì)胞生長的作用，具有劑量依賴性，通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞和空載體病毒組細(xì)胞相比，重組腺病毒載體感染的細(xì)胞變圓，體積稍大，細(xì)胞間的連接較疏松。提示抑制ERCCl基因表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞生長受到一定的抑制，抑制率為1%～30%，表明ERCCl基因蛋白在維持腫瘤細(xì)胞生長中發(fā)揮一定的作用[1，3]。

通過體外藥敏試驗(yàn)證實(shí)，感染空載體腺病毒的細(xì)胞IC50無明顯改變，腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性無明顯增加，增加劑量后亦無明顯改變。重組腺病毒可增加SKOV3的順鉑敏感性，且隨著病毒感染復(fù)數(shù)的增加，腫瘤細(xì)胞殺傷作用增強(qiáng)。與感染空載體腺病毒的細(xì)胞相比，SKOV3細(xì)胞在感染了逐漸增加感染復(fù)數(shù)的重組腺病毒后，腫瘤細(xì)胞IC50逐漸下降，腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性分別增加了9.4%、16.4%、23.2%、33.5%，提示重組腺病毒對SKOV3具有順鉑增敏作用，并且呈劑量依賴性。

流式細(xì)胞技術(shù)檢測單純重組腺病毒處理后，SKOV3細(xì)胞周期和凋亡率發(fā)生改變，G1期比例增大，S期比例減小，G2/M期比例減小，細(xì)胞凋亡率有所增高，表明腺病毒具有G1期阻滯和促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡的作用，重組腺病毒聯(lián)合DDP處理SKOV3細(xì)胞后，與單純順鉑處理組相比，G1期細(xì)胞比例明顯減少，S期細(xì)胞比例明顯增加；G2/M期比例減少，細(xì)胞凋亡率顯著增高，表明重組腺病毒可通過調(diào)節(jié)DDP對SKOV3的S期阻滯及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等途徑增強(qiáng)DDP的化療敏感性。而空載體病毒聯(lián)合順鉑作用下，與單獨(dú)順鉑治療組相比，細(xì)胞周期分布相近，不增加細(xì)胞凋亡。表明空載體病毒不影響順鉑對于SKOV3細(xì)胞周期的作用。

綜上所述，重組腺病毒可以增加順鉑對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，其機(jī)制可能為重組腺病毒通過抑制DNA損傷的NER途徑修復(fù)途徑，增加了順鉑的S期阻滯作用，增強(qiáng)了順鉑的細(xì)胞DNA損傷效果，并同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。并且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明空載體腺病毒對于細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡無影響，是一種優(yōu)良的基因載體。由此我們認(rèn)為，以腺病毒為載體，以ERCCl為靶點(diǎn)進(jìn)行基因治療可提高卵巢癌順鉑化療的敏感性，該方法可望成為提高卵巢癌化療療效的新方法。

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