46例肥胖者腸道腸桿菌菌群與內(nèi)毒素的調(diào)查研究

孫 麗 張?jiān)姾?/p>

細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）或細(xì)菌內(nèi)毒素（endotoxin,ET）是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上的特有結(jié)構(gòu)，其成分主要是O-特異性鏈、核心多糖和類(lèi)脂A三部分組成。1～2歲期間腸道菌群基本形成，并在一生當(dāng)中保存相對(duì)穩(wěn)定[1]。正常菌群的種類(lèi)、數(shù)量和分布是一種動(dòng)態(tài)的相對(duì)穩(wěn)定，受年齡、人種、膳食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣等因素的影響而不同。肥胖癥患者腸道內(nèi)內(nèi)毒素產(chǎn)生菌過(guò)度增長(zhǎng)是否是其肥胖發(fā)生的重要原因之一，本文研究如下：

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2015年1月22日-2016年12月16日本醫(yī)院住院病人和門(mén)診體檢者的糞便標(biāo)本30 g。入選標(biāo)準(zhǔn)為BMI＞30和血清內(nèi)毒素（LPS）的含量大于5 pg/mL（最低檢測(cè)下線）的肥胖癥患者。

1.2 內(nèi)毒素測(cè)定 采用MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)及試劑盒（北京金山川科技發(fā)展有限公司），用動(dòng)態(tài)濁度法對(duì)患者血清進(jìn)行檢測(cè)。取靜脈血2 mL，離心1000 rpm，l min，制備出待測(cè)血清備用。

1.3 糞便細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)及培養(yǎng) 稱(chēng)取0.5 g糞便加入50 mL磷酸鹽緩沖液（PBS)震蕩均勻，其作為10-2稀釋度，再用PBS稀釋到10-10備用，分別取0.1 mL前述備用稀釋液，用涂菌棒涂羊血瓊脂、SS、麥康凱、沙保羅、四號(hào)瓊脂，以及腸桿菌顯色培養(yǎng)基。分別做需氧菌、厭氧菌和真菌培養(yǎng)，挑選菌落最清楚的一個(gè)濃度計(jì)算菌量。每克標(biāo)本的菌落數(shù)(CFU/g)=0.1×適當(dāng)稀釋級(jí)特征菌落數(shù)(為3個(gè)復(fù)樣的均數(shù))×稀釋倍數(shù)。

1.4 菌株鑒定 全部菌株均使用Viteck2系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。菌株生化鑒定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株為ATCC25922，ATCC25923，ATCC27853，ATCC700603均來(lái)購(gòu)自安徽省臨床檢驗(yàn)中心。

1.5 大腸埃希菌16SrDNA PCR及電泳 ①挑取大腸埃希菌落放入LB培養(yǎng)液中增菌，富集細(xì)菌，用革蘭陰性菌DNA提取試劑盒（北京卓誠(chéng)惠生生物科技有限公司）。②引物及PCR體系：通用引 物R1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，R2：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’；PCR體系：10 X PCR Buffer (含Mg離 子)5模板DNA 50 ng，用ddH2O補(bǔ)充到50體系。③反應(yīng)程序：94 ℃，1 min，94 ℃，1 min，50℃，1 min，72℃，1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min，25 ℃，5min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.6 內(nèi)毒素質(zhì)控 用革蘭陰性菌脂多糖質(zhì)量控制品（購(gòu)于北京金山川科技發(fā)展有限公司）進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，注意批號(hào)的更換時(shí)導(dǎo)入新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Logistic多因素分析LPS所測(cè)的值與腸道菌落計(jì)數(shù)之間的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果 46例肥胖者腸道菌群血漿標(biāo)本內(nèi)毒素含量最高為37.26 pg/mL，最低7.009 pg/mL；以50 pg/mL為陽(yáng)性臨界值時(shí)，血漿內(nèi)毒素含量檢測(cè)均在正常范圍內(nèi)。

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果 46例肥胖者糞便培養(yǎng)出大腸埃希菌42例（占91%），非大腸埃希菌4例（占9%）。46例肥胖者糞便同時(shí)培養(yǎng)出2種腸桿菌的6例（13%），男女各半。42例肥胖者糞便同時(shí)培養(yǎng)出大腸埃希菌和腸球菌的2例（4%），男女各1例。42例肥胖者糞便培養(yǎng)出酵母菌的為2例（4%），均為女性。LPS所測(cè)的值與腸道菌落計(jì)數(shù)大小趨勢(shì)呈正相關(guān)（r=0.93，P＜0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 46例肥胖者糞便LPS值與腸道菌落計(jì)數(shù)的關(guān)系圖

2.3 大腸埃希菌16SrDNA PCR電泳結(jié)果 46例肥胖者糞便培養(yǎng)出大腸埃希菌16SrDNA PCR電泳結(jié)果顯示，在瓊脂糖相當(dāng)于Marker的1500bp處出現(xiàn)PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。見(jiàn)圖2。

圖2 46例肥胖者糞便培養(yǎng)出大腸埃希菌16SrDNA PCR電泳結(jié)果

3 討 論

人體腸道菌群(Intestinal nom)棲息著大約30屬細(xì)菌，超過(guò)1000多種細(xì)菌，其總重量大約1.5千克，細(xì)菌總數(shù)達(dá)1012～1014，編碼的基因數(shù)量至少是人體自身基因的100倍[2]。腸道細(xì)菌在促進(jìn)食物消化、合成蛋白質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抵御外來(lái)致病菌侵入以及增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等方面有著重要作用。腸道菌群通過(guò)多種機(jī)制參與機(jī)體的能量代謝、維持機(jī)體的能量平衡，包括促進(jìn)腸道微絨毛的生長(zhǎng)、不能被消化的膳食纖維等的酵解、肽類(lèi)或蛋白質(zhì)的無(wú)氧酵解、結(jié)合膽汁酸的生物轉(zhuǎn)化、草酸鹽復(fù)合物的降解及一些維生素的合成。

腸道菌群與人體共同進(jìn)化，為宿主提供其自身不具備的酶和生化代謝通路。腸道菌群通過(guò)與人體和外界環(huán)境相互作用，影響人體的營(yíng)養(yǎng)、免疫和代謝[3]。腸道細(xì)菌是影響肥胖和脂肪蓄積的環(huán)境因素[4]。腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)和功能變化引起肥胖部分作用是通過(guò)增加吸收食物中的能量實(shí)現(xiàn)的，尤其是降解食物中的多糖，基因分析發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠腸道細(xì)菌富含降解糖類(lèi)等的能量攝入相關(guān)的基因[5]。腸道細(xì)菌能合成大量糖苷水解酶，將植物多糖轉(zhuǎn)變?yōu)閱翁恰⒍替溨舅幔╯hort chain fatty acids，SCFAs）、乙酸、丙酸、丁酸。世界衛(wèi)生組織（WHO）根據(jù)BMI 將通常說(shuō)的“肥胖”分為超重和肥胖兩個(gè)層次，超重是指25≤BMI＜30[6]，肥胖是BMI＞30。本次實(shí)驗(yàn)中大腸埃希菌VITEK2鑒定和16SrDNA PCR電泳結(jié)果一致，可以認(rèn)為鑒定結(jié)果正確。腸桿菌容易產(chǎn)生內(nèi)毒素，而腸道中乳酸桿菌和糞便雙歧桿菌等不易產(chǎn)生內(nèi)毒素，紅酒可以改變菌群分布[7]。

綜上所述，在小鼠實(shí)驗(yàn)中證實(shí)[8]由飲食導(dǎo)致的肥胖者其內(nèi)毒素升高，而本實(shí)驗(yàn)證實(shí)其腸道菌群中腸桿菌多是大腸埃希菌為主，輔以陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、腸球菌和酵母菌，其菌量多少與LPS大小趨勢(shì)一致。

參考文獻(xiàn)

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