干巴菌揮發性化學成分的HS-SPME-GC-MS分析*

葉肖辰皓，姜珊珊，葉 敏**

（1.煙臺大學化學化工學院，山東 煙臺 264005；2.云南農業大學云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201）

干巴菌（Thelephora ganbajun） 也叫對花菌、馬牙菌，是傘菌綱（Agaricomycetes） 革菌目（Thelephorales） 革菌科（Thelephoraceae） 革菌屬（Thelephora） 的1種風味獨特的高等可食用真菌[1]。干巴菌對生態環境要求特殊、地域分布特征極為明顯，僅分布在云南省的昆明、呈貢、嵩明、安寧、楚雄、易門、保山、曲靖、馬龍等地海拔為1 000 m～2 200 m的弱酸性紅土山林中，且該菌與松樹有外生菌根關系，難以實現人工栽培[2-4]。干巴菌不僅具備獨特、濃郁鮮香的風味，還富含氨基酸、蛋白質、黃酮、粗多糖、礦質元素、維生素等大量營養物質，具有很高的營養和保健價值，是1種極具云南特色的珍貴野生食用菌[5-6]。經廣泛的文獻檢索發現國內外對干巴菌的研究十分有限，現有研究主要集中在分類、菌種分離、營養成分測定和生態學關系等方面，對其揮發性化學成分的分析研究相對較少。呂瑜平等[7]采用水蒸氣蒸餾和乙醚萃取法提取干巴菌的揮發油，經氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 分離和鑒定了云南干巴菌中揮發成分。王茜茜等[7]分別采用靜態頂空和頂空固相微萃取法，提取云南野生干巴菌的香氣成分，利用氣相色譜-質譜聯用進行定性定量分析，對2種方法所得的香氣成分進行了比較。

固相微萃取（solid-phase micro-extraction,SPME），適用于分析揮發性有機化合物。由于熔融石英纖維涂附的固定相不同，對各種不同待測物質的吸附和富集能力差異較大，使用固相微萃取技術進行揮發性化學成分分析，必須正確選擇和使用不同類型的吸附纖維。

檢索現有文獻結果表明，采用不同種類的固相微萃取吸附纖維萃取干巴菌揮發性化學成分，并用氣質聯用進行分析的研究鮮有報道。采用Carboxen/PDMS、PDMS和DVB/CAR/PDMS三種不同特性的SPME吸附纖維，利用頂空（head space，HS） 萃取干巴菌的揮發性化學成分，并用氣質聯用儀進行分析，通過比較3種吸附纖維所吸附的揮發性物質種類和含量的差異，推測干巴菌的主要香氣成分，為后續干巴菌的揮發性化學成分的系統研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試野生干巴菌采自昆明市富民縣羅免鄉山地松樹林，樣品采摘后立即帶回實驗室進行揮發性化學成分的SPME頂空收集。

1.2 實驗儀器

氣相色譜-質譜聯用儀Agilent 7890A/5975N（美國Agilent公司）；HP-5MS石英毛細管柱，30.00 m×0.25 mm × 0.25 μm （美國 J&W Scientific 公司）；電子分析天平（AL-104型）、Mettler Toledo（儀器有限公司）；固相微萃取手動進樣手柄（57330-Supelco）、美國（Supelco公司）；固相微萃取頭，100 μm PDMS、 75 μm Carboxen/PDMS 和 50/30 μm DVB/CAR/PDMS（美國Supelco公司）；50 mL頂空萃取瓶（上海安譜科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

將洗凈的50 mL頂空萃取瓶至于180℃下烘烤1 h，除去瓶中揮發性物質，冷卻后將5 g干巴菌置于其中，25℃平衡60 min后分別使用3種SPME纖維（100 μm PDMS、75 μm Carboxen/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS）吸附其揮發物。SPME纖維在使用前，于250℃、50 mL·min-1條件下氮吹老化30 min，然后將SPME纖維插入頂空萃取瓶吸附30 min后立即在GC-MS進樣口230℃解吸附5 min，同時進行GC-MS數據采集。

1.3.1 氣相色譜條件

柱箱初始溫度40℃，保持2 min，以5℃·min-1升至250℃，保持6 min，總運行時間50 min；進樣口溫度為230℃；載氣為高純氦氣（純度99.999%），流量 1.0 mL·min-1，無分流進樣。

1.3.2 質譜條件

電離方式為電子轟擊（EI） 電離，電離能量70 eV；接口溫度280℃，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，離子掃描范圍m/z 50～550；溶劑延時4 min。

1.3.3 化合物定性與定量

經NIST 08質譜數據庫檢索定性，按相似度＞80%的原則作為鑒定結果，按峰面積歸一化法計算化合物的相對百分含量。

2 試驗結果分析

2.1 干巴菌揮發性化學成分的組成

用3種不同極性的SPME吸附纖維吸附干巴菌的揮發性化學成分，并用GC-MS進行分析鑒定。3種不同吸附纖維所得的GC-MS總離子流圖如圖1所示。

從圖1可以看出，在檢測到的干巴菌揮發性成分中硫醚類和烯烴類化合物在含量較高，是干巴菌的主要揮發性化學成分。在分離鑒定的24種揮發性化學成分中，含有烯烴類化合物8種、醇類化合物4種、苯2種、酮、肟、硫醚類化合物各1種，另有其他化合物7種，詳見表1。

圖1 不同SPME吸附纖維萃取干巴菌揮發性化學成分的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds of Thelephora ganbajun extracted by different SPME fiber coating

由表1可知，不同的SPME吸附纖維對干巴菌揮發性成分吸附的種類有較大差異。DVB/CAR/PDMS共檢測到21種揮發性成分，Carboxen/PDMS共檢測到11種揮發性成分，而PDMS僅檢測到有3種揮發性成分，PDMS是3種SPME吸附纖維中吸附揮發性化學成分最少的1種吸附纖維。有少數的化合物能被3種SPME纖維吸附，而大多數化合物則只能被1種或2種纖維吸附。Carboxen/PDMS和DVB/CAR/PDMS共同檢測到的組分有二甲基二硫醚（Dimethyl disulfide）、二甲基硅氧烷環三聚物（Dimethylsiloxane cyclic trimer）、1R-α-蒎烯（1R-α-Pinene）、莰烯 （Camphene）、 (-)-α-蒎烯（(-)-α-Pinene）、八甲基環四硅氧烷 （Oktamethylcyklotetrasiloxan）、桉葉油醇（Eucalyptol）、1-十一烯（1-Undecene）、 (-)-樟腦（(-)Camphor） 和十甲基環戊硅 氧 烷 （Decamethylcyclopentasiloxane）。 PDMS、Carboxen/PDMS和DVB/CAR/PDMS三種吸附纖維共同檢測到的組分僅有1-十一烯（1-Undecene）。

表1 3種不同吸附纖維萃取的干巴菌揮發性化學成分及其相對含量Tab.1 The volatile compounds and their relative contents of Thelephora ganbajun extracted by three different SPME fiber coatings

2.2 不同SPME吸附纖維吸附揮發性成分能力的差異

PDMS、Carboxen/PDMS和DVB/CAR/PDMS 3種吸附纖維吸附化合物的總峰面積如圖2所示。

圖2 3種不同SPME纖維吸附干巴菌揮發性成分的總峰面積Fig.2 Total peak areas of volatile compounds of Thelephora ganbajun extracted by different SPME fiber coating

圖2研究結果表明，不同的SPME吸附纖維對揮發性化學成分的吸附能力不同，其中Carboxen/PDMS的吸附能力最強；DVB/CAR/PDMS次之，Carboxen/PDMS吸附的總峰面積為 76.17%；而PDMS吸附能力最弱，吸附的總峰面積僅為Carboxen/PDMS的3.89%。3種不同SPME吸附纖維對干巴菌中不同揮發性化學成分的吸附能力差異很大，具體試驗結果如圖3所示。

從圖3可以看出，各吸附纖維對不同揮發性化學成分的吸附能力差異很大，Carboxen/PDMS對二甲基二硫醚表現出特異的高吸附能力；DVB/CAR/PDMS對二甲基二硫醚也表現出較高的吸附能力，而PDMS則對二甲基二硫醚無響應；3種纖維對1-十一烯均能吸附，但DVB/CAR/PDMS的吸附能力最強，Carboxen/PDMS次之，PDMS的吸附能力最弱。

圖3 3種不同吸附纖維萃取的干巴菌揮發性化學成分峰面積比較Fig.3 Comparison of volatile compounds from Thelephora ganbajun extracted by three different fiber coating

3 討論

云南因其特殊的地理環境和獨特的氣候條件，非常適合野生食用菌的生長。云南的野生食用菌種類占中國野生食用菌種類的67%以上，占全世界野生食用菌種類的50%[1]。在云南眾多的野生食用菌中，干巴菌是一種風味獨特的珍稀野生食用菌，因其香味濃郁、滋嫩香甜、肉質堅韌，且有一種酷似腌牛肉干的濃郁香味，而得名干巴菌，廣受人們喜愛。干巴菌除風味獨特外還富含抗氧化物質，Xu D.P等[8]采用超聲波輔助提取法提取干巴菌中的抗氧化物質，研究了提取物對人體癌細胞的抗增生作用。研究結果表明，干巴菌的提取物對人體肺癌細胞（A549）、乳腺癌細胞 （MCF-7）、肝癌細胞（HepG2）和結腸癌細胞（HT-29） 均有抗增生作用，其中以對肝癌細胞和肺癌細胞的抗增生作用尤為顯著，干巴菌提取物中的蕓香甙（rutin）、2-苯丙酸（2-hydrocinnamic acid） 和表兒茶酸 （epicatechin），可能是抗氧化和抗增生作用的主要活性化合物。

固相微萃取（SPME）是一種新興的無溶劑特殊萃取方法，適用于各種揮發性有機化合物的萃取，被廣泛地應用于花卉、蘑菇、葡萄酒等的香氣成分萃取和分析，關于其應用已有很多文獻報道[9-12]。本研究中采用 Carboxen/PDMS、PDMS和 DVB/CAR/PDMS 3種不同特性的SPME吸附纖維，結合GCMS聯用技術從干巴菌中的共檢測到24種揮發性化學成分，這些揮發性化學成分主要為硫醚類和烯烴類化合物，相對含量大于5%的化合物有二甲基二硫醚、1R-α-蒎烯和1-十一烯，根據相對含量的占比來分析可以判斷野生干巴菌的特征香氣成分為二甲基二硫醚、1R-α-蒎和烯1-十一烯。Majid[9]研究表明HS-SPME法檢測到的云南野生干巴菌的揮發性成分有主要是醛類、酮類和弱極性的烴類化合物，本研究中也發現野生干巴菌中烴類化合物含量較高，但酮類化合物含量較低，沒有檢測到醛類化合物，這可能與野生干巴菌的生長環境、生長階段和所使用的SPME吸附纖維種類不同等因素有關。不同極性的SPME吸附纖維吸附揮發性成分差異明顯， Carboxen/PDMS檢測到11種揮發性成分，且對二甲基二硫醚具有特異的高吸附能力；在采用的3種SPME吸附纖維中，DVB/CAR/PDMS檢測到的揮發性成分最多，檢測到6種烯烴類化合物、3種醇類化合物、2種苯、1種硫醚類化合物、1種酮類化合物、1種肟類化合物和7種其他化合物，可能是因為DVB/CAR/PDMS由碳分子篩和聚二甲基硅氧烷復合材料制成，該吸附纖維有較多微孔，能夠吸附痕量揮發性成分[13]，但其對二甲基二硫醚的吸附能力不如Carboxen/PDMS；PDMS僅檢測到3種揮發性成分，是試驗選用的3種吸附纖維中檢測到揮發性成分最少的1種，證明PDMS不適用于干巴菌揮發性化學成分的萃取和分析。干巴菌揮發性化學成分的相對含量比較分析結果表明，干巴菌的主要揮發性化學成分是二甲基二硫醚、1R-α-蒎烯和1-十一烯，這三種化合物均具有特殊的香氣，可以推測這三種物質是影響干巴菌風味的關鍵揮發性化學成分。