5，6-二甲基苯并咪唑（DMB）對丙酸桿菌生長及合成脫氧腺苷鈷胺素的影響

王鵬 李路偉 郭金鳳 徐凱莉 董哲

摘 要：在丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）厭氧發酵生產脫氧腺苷鈷胺素（deoxyadenosylcobalamin，簡稱ADO）的過程中，中間體腺苷鈷啉醇酰胺（adenosylcobinamide，簡稱CBI）和5，6-二甲基苯并咪唑（DMB）結合后生成產物ADO。目前維生素B12脫氧腺苷鈷胺素發酵過程中的實時在線檢測方法相對匱乏，為了解決該問題，提高維生素B12的發酵單位，以CBI為目標，運用代謝調控方法改善DMB的加入時間，研究不同時間加入DMB對丙酸桿菌生長以及ADO合成的影響。在分批次發酵情況下，實時檢測了菌體發酵過程中具體的CBI合成量、ADO產量，并進一步繪制了菌體的生長曲線。結果表明，DMB對丙酸桿菌生長的抑制作用并不明顯，但是可以抑制單位菌體產量，發酵周期為120 h，最佳添加時間為90～100 h，相比60 h添加DMB可提高發酵單位59.08%。方法簡便、快捷、高效，對維生素B12的發酵調控研究具有一定的參考價值。

關鍵詞：發酵工程;脫氧腺苷鈷胺素（ADO）;丙酸桿菌;腺苷鈷啉醇酰胺（CBI）;5，6-二甲基苯并咪唑（DMB）

中圖分類號：Q815?文獻標志碼：A

文章編號：1008-1542（2018）06-0546-06

維生素B12別稱鈷胺或氰基鈷胺，是一類含鈷的咕啉類有機化合物的總稱，主要以5種天然形式存在：甲基鈷胺（methylcobalamin）、脫氧腺苷鈷胺（deoxyadenosylcobalamin）、羥基鈷胺（hydroxycobalamin）、水合鈷胺（aquacobalamin）和硝基鈷胺（nitrylcobalamin）[1-2]。廣泛應用于商品用途的維生素B12是由細菌菌體發酵合成的鈷胺素轉化而來的[3-4]。維生素B12與人們的生產、生活聯系密切，例如在農業上主要用作飼料添加劑，在臨床上用來治療神經系統疾病和惡性貧血等。

目前，工業生產中的脫氧腺苷鈷胺素（ADO）發酵采用好氧和厭氧工藝。第1種工藝是假單孢菌好氧發酵，發酵單位較高，但發酵過程需要曝氣及高功率攪拌，能耗較高。第2種工藝則為丙酸桿菌厭氧發酵，雖然厭氧發酵工藝產率較低，但發酵過程中不需要曝氣和高功率攪拌，能耗較低。工業上應用最普遍的維生素B12產生菌之一是丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）[5-7]，在其生長發酵中不會產生內、外毒素[8]，

發醇廢液含有細菌類物質及丙、乙酸鹽類，都具有生物抗菌作用，可作為天然、綠色、安全的食品和飼料防腐劑[9]，符合美國食品和藥物管理局GRAS標準。綜合考慮2種發酵工藝的成本相差不大，故選擇丙酸桿菌厭氧發酵工藝。丙酸桿菌厭氧發酵生產ADO分2個階段：第1個階段，以增加菌體數量為目的培養發酵菌體，同時積累中間產物腺苷鈷啉醇酰胺（CBI）;第2個階段，向培養基中加入5，6-二甲基苯并咪唑（DMB），促使菌體合成維生素B12脫氧腺苷鈷胺素[10-11]。相關研究討論了DMB合成以及在生產中添加DMB的必要性[12-14]。

目前對于維生素B12的厭氧發酵過程，企業缺乏實時在線監控方法，大多采用鏡檢，人為影響因素較大，發酵不穩定。此外，關于在發酵生產維生素B12的過程中，添加DMB是否對丙酸桿菌生長有影響，以及在什么時間添加DMB可得到最優產量的研究并不多。筆者采用簡便、快捷、高效的液相色譜實時在線監控方法，探討了添加DMB對菌體生長及合成ADO的影響，并運用代謝調控的方法對發酵過程進行優化，提高了維生素B12的發酵單位。

1?材料與方法

1.1?菌種來源

菌種丙酸桿菌Propionibacterium freudenreichii，CICC：10019，由中國工業微生物菌種保藏中心提供。

1.2?培養基配方

種子培養基配方（質量分數，下同）：葡萄糖3.5%（需要單獨滅菌），玉米糖漿2.1%，碳酸鈣0.4%，磷酸二氫鉀0.4%，硫酸銨0.5%，氯化鈷0.000 5%。用自來水配制，pH值為6.8～7.0，加碳酸鈣。

發酵培養基配方：葡萄糖6%，玉米糖漿4%，磷酸二氫鉀0.46%，氯化鈷0.001 27%。用自來水配制，pH值為6.8～7.0，加碳酸鈣。

1.3?主要設備和試劑

美國Waters公司 2695高效液相色譜儀，Beckman C18（4.6 μm×25 cm，5 μm）色譜柱，福特斯（FTS）冷凍干燥機，Sigma 3K30高速離心機，Sartorius arium 611UF純水機，Beckman J6-MC大體積離心機，Sonics & Materials公司生產的Uibracell超聲波細胞破碎儀。

標準品ADO來自于Sigma公司;乙腈，色譜純;冰乙酸，色譜純;氫氧化鈉，分析純。

1.4?丙酸桿菌的發酵

取穿刺培養的細菌，用生理鹽水沖洗，接種到種子培養基，在30 ℃靜置培養50 h。取10%的種子液接種到發酵培養基中，在30 ℃下發酵培養，用氨水調節pH 值為6.8～7.0。在細菌菌體發酵過程中于不同時間加入DMB，促使丙酸桿菌積累ADO。

1.5?丙酸桿菌的收集與處理

在離心轉速4 000 r/min時收集丙酸桿菌發酵液，菌體凍干。取單位質量的干菌配制成2.5%的懸浮液，然后在沸水浴中加熱30 min使細胞破壁ADO釋放。在轉速10 000 r/min離心收集上清液，取1 mL通過0.2 μm纖維素濾膜過濾，最后用高效液相色譜儀檢測ADO產量[15]。整個操作過程在避光下進行，以防止光降解。

1.6?分析方法

1.6.1?生物量的測定

采用7200型分光光度計測量吸光度。取1 mL發酵液，參數波長為600 nm，光程1 cm比色皿比濁，以OD表示生物量。

1.6.2?CBI及ADO的檢測方法

液相條件：流動相1為乙腈，流動相2為醋酸鈉緩沖液（pH值為3.5），檢測波長為254 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL。

洗脫條件：15%乙腈恒速洗脫5～10 min，15%～30%乙腈梯度洗脫10～15 min。

質譜條件：噴霧電壓為4.5 kV，自加熱金屬毛細管溫度為300 ℃，電噴霧離子源殼氣速為50 arb。全掃描檢測模式，掃描范圍為m/z 300～1 200，精確質量數與二級質譜（MS/MS）的掃描方式為數據依賴型。

全部數據是經3次試驗所取的平均值。

2?結果與分析

2.1?發酵過程中CBI的合成研究

筆者在原有實驗基礎上，已經得到一個關鍵且穩定的中間體，并通過光譜和液-質聯用分析推測此中間產物為腺苷咕啉醇酰胺（CBI），相對分子質量為1 239。CBI結構如圖1所示。研究發現，丙酸桿菌在發酵過程中，CBI隨菌體的生長而積累，到一定程度時加入5，6-二甲基苯并咪唑（DMB），可以快速轉化為維生素B12即ADO，但是不加DMB，丙酸桿菌將不能生成ADO[16]。

對中間產物采用液-質聯用分析，結果如圖2所示。

該中間體在被離子化后呈現出了+1價，相對分子質量為1 239.5，恰好同ADO-CBI厭氧生物合成途徑中的脫氧腺苷鈷啉醇酰胺（ADO）一致。ADO-CBI的分子結構中相對于ADO-CBI缺少了磷酸基團、核糖基團以及DMB基團（ADO-CBI分子質量比為1 580）。另外，圖2中988.7 nm處對應的峰同ADO-CBI缺少了腺苷（ado-）基團的鈷啉醇酰胺一致。由此可以得出結論：從實驗中分離得到的關鍵中間產物應該是CBI。圖2中，1 240.6 nm處對應的是CBI的加H峰。

2.2?DMB添加時間對ADO合成的影響

發酵過程中以不添加DMB為對照，分別在24，36，…120 h（間隔12 h）添加DMB，在120 h左右發酵結束后檢測最終ADO合成量，對照定時取樣測定CBI的合成量和OD值。結果如圖3和圖4所示。

由圖3可以看出，在丙酸桿菌厭氧發酵生產ADO的過程中，OD值一直增大，在90～96 h之間生物量OD值最大，最后逐步平穩;CBI在60 h前后初次生成，90 h達到了最大值，隨后略微減小。由圖4可知，ADO合成量與CBI的生成有密切聯系，在84 h CBI的合成量達到最大時添加DMB，合成終止后ADO可以達到最大產量;對比在60 h加入DMB，維生素B12即ADO產量可以提高59.08%，產量大幅提高，效果明顯。

2.3?DMB對合成CBI的影響

2.3.1?DMB在CBI最大量左右時加入

在丙酸桿菌厭氧發酵生產ADO的過程中，以不加入DMB為對照，在96 h時加入DMB，全過程按小時定時取樣測定生物量OD值、CBI以及ADO合成量。結果如圖5所示。

由圖5可知，隨著發酵的進行OD值不斷升高，在96 h時到達最高值，后續逐步穩定。對照中間產物CBI在60 h前后開始生成，96 h達到最大值，然后有小幅度降低，但仍保持在較高的水平。在96 h加入DMB后CBI不斷減少，同時開始生成鈷胺素ADO。隨著反應的進行ADO合成量越來越多，123 h 時CBI徹底消失，ADO達到最大量，在124 h中間產物全部轉化成產物脫氧腺苷鈷胺素。

2.3.2?DMB不在CBI最大量時加入

在丙酸桿菌厭氧發酵生產ADO的過程中，以不加入DMB為對照，于74 h時加入DMB，全過程定時取樣測定生物量OD值、CBI以及ADO合成量。結果如圖6和圖7所示。

由圖6可知，未加DMB和加DMB兩者的OD值都持續增大，在90 h時到達最大值后逐步穩定，加不加DMB對OD值的變化沒有直接的影響。由此可知，DMB對丙酸桿菌的毒害效應不是很明顯。加與不加DMB的發酵液兩者的OD值不同，但無明顯規律。對照CBI不斷生成，在96 h到達最大量后逐步穩定。由圖7可知，添加DMB后，CBI量快速減少，此時產物ADO開始生成并且產量逐步增大。在102 h 時CBI徹底消失，ADO產量在108 h達到最大值。由此可知，由CBI全部轉化為ADO大約需要34 h。

2.4?DMB對細菌菌體生長的影響

在丙酸桿菌厭氧發酵生產維生素B12的過程中，DMB分別于發酵早期0 h，24 h和對數生長期48 h加入，以不加入DMB為對照，全過程定時取樣測定生物量OD值（間隔12 h）、CBI以及ADO合成量，檢驗分析DMB對丙酸桿菌菌體的生長是否有毒害作用。結果如表1和圖8所示。

由表1和圖8可以看出，DMB對細菌生長有略微的毒害作用，但是作用并不明顯。在菌體厭氧發酵完全結束停止后測定脫氧腺苷鈷胺素ADO的產量，綜合分析可知DMB加入的時間越早，ADO的產量越低。

優化發酵過程也可從代謝工程的角度出發，利用基因工程操縱代謝途徑[17]，在丙酸桿菌厭氧發酵脫氧腺苷鈷胺素的過程中，強化目標產物途徑，控制或消除副產品途徑[18-19]，特別是對ADO發酵過程中的丙酸桿菌、副產物丙酸抑制菌體的生長[20]，從而進一步影響ADO的發酵單位。因此，新型發酵工藝是另一種可以顯著提高ADO產量和效價的途徑，比如采用產物原位分離技術[21-22]。

3?結?語

1）目前，在維生素B12的發酵生產中，添加DMB的時間只是根據生產經驗進行判斷，并沒有較為科學的理論可遵循。筆者認為，可采用生物發酵代謝工程手段來確定適宜誘導物DMB的加入時間，從而得到更高的發酵單位。例如：隨著丙酸桿菌菌體的生長發酵，CBI在菌體內持續生成并不斷累計，該合成直接關系到ADO的最終產值;在丙酸桿菌厭氧發酵生產維生素B12的過程中，全程定時取樣跟蹤檢測CBI產量，當其生成量到達最大值時加入DMB，CBI將快速轉化生成產物ADO，有效提高了發酵單位。在發酵90～96 h添加DMB，維生素B12的產量可以提高到59.08%。

2）在丙酸桿菌厭氧發酵合成ADO的過程中，DMB對丙酸桿菌菌體的毒害作用不是很明顯，生物量也沒有明顯減少;但是過早加入誘導物DMB則情況相反，其會抑制合成中間體CBI，減少菌體量，降低維生素B12脫氧腺苷鈷胺素最后的產量。

3）本研究為維生素B12發酵過程檢驗檢測技術的開發提供了理論依據。在丙酸桿菌厭氧合成ADO的次級代謝途徑中，DMB為何對CBI的合成有抑制作用有待今后作進一步的研究。

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