姜黃素長循環脂質體的制備及表征

任婧 張丹參 侯文書 武春陽 馬佳呈

摘 要：為了改善姜黃素長循環脂質體（Cur-LCL）的穩定性，延長藥物在體內的循環時間，對現有姜黃素脂質體（Cur-Lips）和姜黃素長循環脂質體的制備方法進行了優化。使用乙醇注入法制備Cur-Lips，用后插法將DSPE-PEG2000插入Cur-Lips中制成Cur-LCL。結果表明：Cur-LCL外觀為圓形囊泡狀球體，平均包封率為（88.91±0.94）%，4 ℃存放15 d包封率沒有明顯變化，平均滲漏率為2.4%，具有較好的穩定性;Cur-LCL平均粒徑為（118.4±3.2）nm（n=3），呈單峰分布，平均電位為（-12.9±0.32）mV（n=3）;以溶解度為標準對溶出介質進行篩選，選擇以1% Tween 80的生理鹽水為體外釋放試驗的溶出介質，Cur原料藥12 h基本釋放完全，Cur-Lips在36 h基本釋放完全，累計釋放率為92.67%，Cur-LCL在72 h基本釋放完全，累計釋放率為91.36%。Cur-LCL具有明顯的緩釋性，可以延長藥物在血液中的循環時間，達到長循環的效果。

關鍵詞：中藥藥劑學;姜黃素;長循環脂質體;包封率;體外釋放

中圖分類號：R844.1?文獻標志碼：A

文章編號：1008-1542（2018）06-0532-08

姜黃素（Cur）[1]是從姜科植物姜黃、莪術、郁金等根莖中提取的一種天然黃色色素，是小分子植物酸性多酚，具有多種藥理作用，且毒性很低[2-3]。近年來發現，姜黃素能抑制β淀粉樣蛋白（Aβ）的合成與蓄積，改善阿爾茨海默病患者的空間學習記憶能力[4]。但是，姜黃素本身因水溶性差、生物利用度低、半衰期短、易降解[5]、不能通過血腦屏障等缺點而制約了自身的發展[6]。

脂質體可以將姜黃素包裹在脂質雙分子層中，用于克服水溶性差和生物利用度低的問題[7-8]，而DSPE-PEG2000可以經后插法插入姜黃素脂質體（Cur-Lips）的磷脂雙分子層中[9-11]，制成長循環姜黃素脂質體（Cur-LCL）。筆者對此進行了研究，修飾后的長循環脂質體可以避免靜脈給藥后血液中巨噬細胞對脂質體的吞噬作用，具有明顯的緩釋效果，可延長藥物在體內的循環時間[12]，提高藥物的穩定性，達到長循環的作用[7]。

1?實驗部分

1.1?主要材料與儀器

姜黃素（西安小草植物科技有限責任公司提供，XC20160815）;姜黃素標準品（中國藥品生物制品檢定研究院提供，110823-201405）;蛋黃卵磷脂（上海艾韋特（A.V.T.）醫藥科技有限公司提供，PC-98T，注射級）;膽固醇（上海艾韋特（A.V.T.）醫藥科技有限公司提供，注射級）;DSPE-PEG2000（上海艾韋特（A.V.T.）醫藥科技有限公司提供，B50845，注射級）;葡聚糖G-50凝膠;乙腈（色譜純）;冰醋酸（色譜純）;其余試劑均為分析純。

BT 224S電子天平，BT100-2J蠕動泵，RE201D旋轉蒸發器，4-15高速離心機，ZEN3690粒度分析儀，e2695 高效液相色譜儀，H-7650 透射電鏡，MODUL YOD-230真空冷凍干燥機，RC8MD溶出試驗儀。

1.2?長循環姜黃素脂質體（Cur-LCL）的制備

采用乙醇注入法制備姜黃素脂質體[13-14]。分別精密稱取姜黃素、蛋黃卵磷脂、膽固醇適量，溶解在少量無水乙醇中，超聲助溶，于40 ℃水浴條件下將無水乙醇溶液滴加到去離子水中，水浴攪拌10 min，旋轉蒸發除去無水乙醇，得到姜黃素脂質體（Cur-Lips）。精密稱取DSPE-PEG2000適量，加入到Cur-Lips中，在EDC和NHS催化下于50 ℃孵育1 h，得到Cur-LCL。

1.3?處方工藝優化

1.3.1?單因素優化制備處方

以包封率為評價指標，進行單因素試驗，分別考察投藥量、膽固醇用量、無水乙醇用量和DSPE-PEG2000用量對Cur-LCL包封率的影響。

1.3.2?正交試驗優化制備工藝

以包封率為評價指標，以水浴溫度、攪拌速度、滴加時間和水合時間為因素進行正交試驗，優化制備工藝，因素與水平見表1。

1.4?理化性質考察

1.4.1?包封率（ER）的測定

采用微柱離心法測量Cur-LCL的包封率。取適量Cur-LCL，滴加于葡聚糖G-50凝膠柱的頂端，離心收集濾液。用適量去離子水洗脫3次，合并濾液于容量瓶中破乳定容，測量吸光度，計算脂質體中包裹的藥物含量：

1.4.2?形態

取適量Cur-LCL，滴在碳支持膜銅網表面上，靜置2 min，使Cur-LCL充分吸附在銅網上。以2%（質量分數，下同）磷鎢酸染液染色2 min，置于透射電鏡下觀察形態。

1.4.3?粒徑與電位

取1 mL的Cur-LCL，加入9 mL去離子水稀釋至10倍，使用馬爾文粒度分析儀分別測定Cur-LCL的粒徑和電位。

1.5?體外釋放試驗

1.5.1?溶出介質的選擇

分別精密稱取5份相同且過量的Cur原料藥，加入到去離子水、PBS（pH值為7.4）、含1% Tween 80的PBS（pH值為7.4）、生理鹽水、含1% Tween 80生理鹽水中，于37 ℃下攪拌48 h，10 000 r/min離心3 min。取上清液測定Cur含量，選擇對Cur溶解度較高的溶出介質作為體外釋放實驗的溶出介質。

1.5.2?溶出曲線的繪制[15]

分別取Cur-LCL，Cur-Lips和等量的游離Cur各3份，置于煮沸處理過的透析袋中，將透析袋封口，懸掛于200 mL的溶出介質中。水浴溫度為37 ℃，轉速為100 r /min，于0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，24，36，48，72 h 時各取樣2 mL，同時補加2 mL溶出介質。將取出的溶液過0.22 μm微孔濾膜后，測定Cur含量，計算累計釋放率，并繪制溶出曲線。

2?結果與討論

2.1?處方工藝優化

2.1.1?單因素優化制備處方

通過對投藥量、膽固醇用量、無水乙醇用量和DSPE-PEG2000用量進行考察，得到單因素試驗結果，見圖1。

脂質體內蛋黃卵磷脂負載能力有限[16]，當蛋黃卵磷脂的量固定不變時，投藥量超過1.5 mg后包封率急劇下降，所以1.5 mg達到了脂質體當前可以包裹藥物的負載上限。膽固醇可以增加脂質的流動性，改善脂質體的外觀和包封率，但膽固醇量過大時會導致脂質體不穩定，膽固醇為10 mg時包封率較高。本試驗用無水乙醇溶解藥物和輔料，無水乙醇用量較少時會導致藥物與輔料的濃度增高，在形成脂質體過程中容易包裹不均勻，造成包封率不高，無水乙醇用量達到3 mL及以上時脂質體包封率變化不大。

有學者研究發現，如果DSPE-PEG2000和蛋黃卵磷脂的質量比超過10%，DSPE-PEG2000將很難插入脂質體的磷脂雙分子層，并且很容易與磷脂形成混合膠束[17-18]。故選取10%以內的比例進行試驗，當DSPE-PEG2000與磷脂的質量比為7%時，包封率較高。

2.1.2?正交試驗優化制備工藝

正交試驗結果見表2。

根據正交試驗的結果，各因素對包封率的影響順序為因素C>因素A>因素D>因素B，制備Cur-LCL的適宜工藝為水浴溫度40 ℃、攪拌速度300 r/min、水合時間10 min、滴加時間120 s。

2.2?理化性質

2.2.1?包封率的測定

分別在葡聚糖-G50凝膠柱頂端滴加Cur-LCL和同等濃度的游離Cur，離心收集濾液，破乳定容測量吸光度，再用適量去離子水洗脫19次，分別破乳定容測量吸光度，繪制洗脫曲線，如圖2所示。

由圖2可以看出，Cur-LCL和游離藥物可以良好分離，且重復測定RSD值≤2%，說明微柱離心法適用于本試驗的包封率測定。

按照較優處方制備工藝分別制備3批Cur-LCL，計算各組的包封率和載藥量，結果如表3所示。由表3可從看出，平均包封率為88.91%，平均載藥量為1.88%，RSD值均小于2%，說明制備方法穩定，重復性較好。于4 ℃保存7，10，15 d后再次測量包封率，結果見表4。

Cur-LCL在4 ℃條件下儲存7 d時測量包封率，并無明顯變化，10 d時脂質體包封率開始出現輕微下降，15 d時測量平均滲漏率為2.4%，證明Cur-LCL具有較好的穩定性。

2.2.2?透射電鏡結果

透射電鏡觀察結果見圖3。

由圖3可以看出，Cur-LCL在2個倍數下均為圓球形囊泡結構，無明顯黏連，未見聚集，分布比較均勻。

2.2.3?粒徑與電位

Cur-Lips的粒徑分布圖見圖4，Cur-LCL的粒徑、電位分布圖見圖5和圖6。由圖4—圖6可以看出：Cur-Lips平均粒徑為（110.5±2.7）nm （n=3），Cur-LCL的平均粒徑為（118.4±3.2）nm （n=3），粒徑均呈單峰分布，分布比較均勻，可見加入的DSPE-PEG2000未使脂質體粒徑明顯增大;Cur-LCL 3次測量的平均電位為（-12.9±0.32）mV （n=3），電位絕對值較大，可以保證脂質體之間的排斥作用力，使脂質體較為穩定。

2.3?體外釋放試驗

2.3.1?溶出介質的選擇

考察了5種溶出介質對姜黃素的溶解能力，結果如表5所示。根據Cur在各種溶出介質中的溶解度情況，選擇溶解度較好的含1% Tween 80的生理鹽水作為體外釋放試驗的溶出介質。

2.3.2?色譜條件

色譜柱：YWG-C18（4.6 mm×250 mm，10 μm）;流動相：乙腈-4%冰乙酸水溶液（二者體積比為48∶52）;流速：1 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長：430 nm;進樣量10 μL。

2.3.3?標準曲線

精密稱取姜黃素標準品適量，用釋放介質溶液溶解，并依次稀釋為0.1，0.5，1，2，5，10，20，50 μg/mL的溶液，用HPLC測量含量，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，如圖7所示。圖7表明，姜黃素質量濃度在0.1～50 μg/mL內線性關系良好。

2.3.4?精密度

分別配制10，30，50 μg/mL 3種質量濃度的姜黃素溶液，每天測量5次，連續測量5天，分別計算日內精密度和日間精密度。日內精密度的RSD值分別為1.23%，0.50%和0.41%，日間精密度的RSD值分別為1.70%，0.62%和0.46%，RSD值<2%。

2.3.5?回收率

分別配制10，30，50 μg/mL 3種質量濃度的姜黃素溶液，加入到1 mL空白脂質體中，破乳后測量姜黃素的質量濃度，計算回收率，結果見表6。由表6可以看出，回收率RSD值均<2%，說明輔料對Cur的含量檢測沒有影響。

2.3.6?穩定性

配制質量濃度為30 μg/mL的姜黃素溶液，每間隔2 h測量姜黃素的含量，測量10 h，考察姜黃素溶液的穩定性，結果見表7。由表7可以看出，姜黃素溶液在含1% Tween 80的生理鹽水中穩定性良好。

2.3.7?體外釋放率

Cur-LCL的體外釋放曲線見圖8。

試驗結果表明：游離Cur在12 h內基本完全釋放，累計釋放率為96.27%，Cur-Lips在36 h時累計釋放率達到92.67%;Cur-LCL則在72 h內基本釋放完全，累計釋放率為91.36%。這說明DSPE-PEG2000的修飾可以放慢脂質體的釋放速度，其原因可能是DSPE-PEG2000在脂質體表面形成了一層水滑膜，減慢了藥物的釋放，從而達到緩釋和長循環的效果[19-20]。

3?結?論

1）選用乙醇注入法制備姜黃素脂質體（Cur-Lips），將DSPE-PEG2000用后插法加入到姜黃素脂質體中，得到姜黃素長循環脂質體（Cur-LCL），平均包封率為（88.91±0.94）%，平均載藥量為（1.88±1.10）%，4 ℃下儲存15 d平均滲漏率為2.4%。

2）Cur-LCL外觀為圓形囊泡狀球體，平均粒徑為（118.4±3.2）nm （n=3），呈單峰分布，平均電位為（-12.9±0.32）mV（n=3），性質較為穩定，可以認為是制備姜黃素長循環脂質體的較好方法。

3）考察了Cur在不同介質中的溶解度，選定1% Tween 80生理鹽水作為體外釋放實驗的溶出介質，原料藥在12 h內基本完全釋放，Cur-Lips在36 h內基本釋放完全，累計釋放率為92.67%，Cur-LCL在72 h內基本釋放完全，累計釋放率為91.36%，說明修飾了DSPE-PEG2000的Cur-LCL具有明顯的緩釋性。

4）在Cur-Lips表面修飾了DSPE-PEG2000，增加了脂質體的穩定性，延長了體外釋放時間，使得藥物在體內的作用時間更長;此外，因為理化性質更加穩定，所以更加便于藥物的儲存和運輸。但脂質體普遍存在載藥量偏低的問題，當投藥量達到輔料負載能力的上限時，隨著投藥量的增加，載藥量反而會下降，而脂質體使用的輔料大多為天然成分，負載能力有限，今后需針對脂質體載藥量的提高加以深入研究。

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