淺析紅細胞凝集抑制試驗的影響因素

胡燕玲 高習文

摘要：在獸用生物制品特別是獸用疫苗產品檢驗過程中，紅細胞凝集抑制試驗在禽滅活疫苗效力檢驗和禽抗體效價測定中應用廣泛，是一個非常基礎的常規的試驗。但是在試驗操作中由于其影響因素較多，很容易造成試驗結果的偏差，對檢驗結果造成影響，因此就紅細胞凝集抑制試驗的影響因素進行分析，給疫苗檢驗操作人員提供參考，以減少彎路。

關鍵詞：紅細胞凝集抑制試驗；影響因素；獸用生物制品

中圖分類號：S852.5

文獻標識碼：B

文章編號：2095-9737（2018）08-0014-01

紅細胞凝集抑制試驗（HI）的原理為雞紅細胞表面存在受體，而某些病毒如雞新城疫病毒等能與雞紅細胞表面受體結合而產生凝集現象，稱為紅細胞凝集（HA），而當這種病毒與相應的特異性抗體相結合后，這種凝集現象則被抑制，稱為紅細胞凝集抑制試驗。試驗依據：中國獸藥典（2015年版）三部附錄3404。根據經驗，有以下幾個主要影響因素需要檢驗人員在試驗中注意。

1 試劑及器材

整個實驗過程中均應按照獸藥典要求使用PBS（O.l mol/L，pH 7.0—7.2，下同），而不是生理鹽水，因PBS緩沖能力較好，實驗結果較為穩定。

操作過程中使用的器材有：50孔反應板、96孔反應板、移液器、槍頭、平皿或移液槽等。

移液器應選用品牌的單道或多道移液器，配套使用品牌移液器槍頭，若槍頭不配套則加液量可能不準，影響實驗結果。使用過程中應嚴格按照移液器說明書要求使用，使用后應旋至最大刻度處保存，并定期校驗，合格方可使用。槍頭應一次性使用，不能清洗后再重復使用。反應板、平皿或移液槽等均應清潔，使用后應立即清洗干凈。若條件允許可選用一次性使用反應板或器皿，一次性使用。對于重復使用的50孔或96孔反應板，應在試驗操作結束后立即清洗。清洗方法為：棄去液體（棄人含有消毒液的盆或桶中），用純化水沖洗各孔，用75%酒精棉球擦拭各孔，然后用純化水沖洗干凈，烘干或自然晾干后備用。注意用棉球擦拭反應板時，應避免刮傷反應孔。對于初學者建議使用50孔板進行試驗，反應結果觀察更為清晰準確，易判定。

2 1%雞紅細胞懸液

若配制的1%紅細胞濃度偏高，則紅細胞凝集試驗（HA）反應結果血凝價會偏低，紅細胞凝集抑制試驗（HI）反應結果抗體效價偏高；若配制的1%紅細胞濃度偏低，則紅細胞凝集試驗（HA）反應結果血凝價會偏高，紅細胞凝集抑制試驗（HI）反應結果抗體效價偏低。因此紅細胞配制濃度對反應結果的影響至關重要。而影響紅細胞懸液濃度的因素分別有紅細胞保護液（阿氏液）、采血過程，紅細胞離心配制過程等。

2.1 阿氏液

阿氏液成分為檸檬酸鈉8g，檸檬酸0.325 g葡萄糖20.5g，氯化鈉4.2 g加純化水至1000 mL。

因檸檬酸的用量較少，稱量要求較為精確，因此應選擇至少精確至0.001 g的電子天平進行稱量；因其中含有較多的葡萄糖，因此不宜采用較高的溫度和壓力進行滅菌，適宜的方法為流通蒸氣滅菌3次，每次30 min，可室溫保存使用。

2.2 采血過程

最好選用2～4只2～6月齡的SPF雞，用一次性或滅菌的5 mL注射器，翅下靜脈采血，抽取血液時速度不能太快也不能太慢，避免溶血及凝血，采血后應立即取下針頭將血液緩緩推入等量的阿氏液或略多于血液量的阿氏液中，輕輕搖勻備用。應避免用針頭直接將血液推入阿氏液中，防止造成溶血。采血后應用干棉球按壓采血部位進行止血。

2.3 1%紅細胞配制

采血后血液置阿氏液中4℃保存或直接離心。離心時應采用1500 r/min離心5—10 min，然后用PBS洗滌3～4次。盡量不使用生理鹽水洗滌，因PBS有緩沖作用，能避免在離心過程中造成溶血。每次洗滌時應盡可能的棄凈上清，在最后一次離心過程中時間一定要達到10 min以上，使紅細胞沉積較為堅實。因無法完全棄凈紅細胞泥上層的白細胞層及上清，因此在最后吸取紅細胞泥時，應將吸管或吸頭插入離心管底部吸取，確保抽取的全部為紅細胞，加入紅細胞后應在瓶中無紅細胞泥處反復輕輕吹吸洗凈吸管或吸頭中黏附的紅細胞。配制好的紅細胞放置2～8℃保存，3～5日內使用，若有條件紅細胞盡可能現用現配。對1%紅細胞懸液可按中國獸藥典（2015年版）三部附錄3404附注要求進行標定，確保配制濃度準確。

3 4倍血凝素對試驗結果的影響

在紅細胞凝集抑制試驗中的關鍵為4倍血凝素的配制，需要準確測定血凝素的凝集價并對配制的4倍血凝素進行檢驗。4倍血凝素配制濃度如果不準確則紅細胞凝集抑制試驗結果會有很大的影響。配制濃度偏高，則紅細胞凝集抑制試驗結果偏低；配制濃度偏低，則紅細胞凝集抑制試驗結果偏高。 在操作過程中需要注意是為了和后續抑制試驗反應體系液體量保持一致，在血凝素凝集價測定和4倍血凝素檢驗過程中需要補加的PBS（具體請參照中國獸藥典2015年版三部附錄）。此外配制好的血凝素可在2～8℃條件下儲存，應現用現配；原液應避免反復凍融，可先分裝成小包裝進行凍存。每次試驗均應先測定血凝素凝集價，避免因使用不同的紅細胞或其他實驗因素變動造成結果的不準確。

4 操作過程

加液時嚴格按照移液器的使用方法，采用多吸少打或全排的加液方式均可，確保加液量準確。

加液過程應避免將液體加到孔外或濺出孔外，造成反應體系量不準確，每次加液時，應避免槍頭接觸反應板孔內液面。

在稀釋過程中，吹吸混勻次數應至少6次，槍頭深入液面深度應適中，避免吸空和濺出。在吹吸混勻后移液時，應排凈吸頭內液體，重新吸取準確量加入下一孔繼續混勻稀釋。紅細胞在使用前應搖勻，加樣孔較多時，應注意經常搖勻。在整個操作過程中應隨時注意移液器液面位置，確保加液量準確。

5 反應環境溫度及判定方法

紅細胞凝集和紅細胞凝集抑制試驗要求實驗反應溫度為室溫（15～25℃）或2～8℃。室溫條件下，20—40 min即可判定，2～8℃條件下需要40～60 min可判定結果。環境溫度較高，則紅細胞凝集試驗及紅細胞凝集抑制試驗反應的時間較短；環境溫度較低，則紅細胞凝集試驗及紅細胞凝集抑制試驗反應的時間較長。判定方法為：在特定溫度及規定的時間內，以紅細胞對照在反應板底部形成邊緣光滑的圓點（即呈顯著紐扣狀）時開始判定.以完全凝集（100%凝集）或完全抑制（lOO%）的最高稀釋倍數作為反應終點。