響應面法優化樹舌靈芝多糖提取工藝

杜鵬瑤 王麗紅 劉德江 張云杰

摘要 [目的]探討熱水提取法提取樹舌靈芝多糖（soluble polysaccharides from Ganoderma applanatum，GASP）的最佳提取工藝。[方法]在單因素試驗的基礎上，運用響應面法對提取的樹舌靈芝多糖（GASP）各項參數進行優化。[結果]提取時間、提取溫度、液料比均對樹舌靈芝多糖提取率有顯著影響，影響大小為提取時間>液料比>提取溫度;最終確定樹舌靈芝多糖提取的最佳工藝條件為提取溫度77 ℃、提取時間138 min、液料比27∶1（mL∶g），該條件下多糖實際提取率為2.57%±0.05%。[結論]響應面法優化樹舌靈芝多糖提取工藝參數切實可靠。

關鍵詞 樹舌靈芝;多糖;提取;響應面

中圖分類號 R284.2文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0148-04

樹舌靈芝[Ganoderma applanatum （Pers.） Pat]別名樹舌、樹舌扁靈芝、平蓋靈芝，隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）非褶菌目（Aphyllophorales）靈芝菌科（Ganodermataceae）靈芝屬（Ganoderma Karst），是藥食同源的大型高等真菌[1]。我國大部分省區均有分布[2]，且廣泛分布于歐洲、亞洲、北美洲等地區的其他國家[3]。樹舌靈芝藥用見于《中國藥用真菌圖鑒》和《長白山植物藥志》，其性平，微苦，能抗癌、止痛、清熱、化積、止血、化痰、消炎解毒[4]。研究表明，樹舌靈芝還具調節免疫力、抗腫瘤、保肝、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血壓等生物活性[5-11]。多糖作為一種天然高分子化合物，具有廣泛的生物活性，近年來受到廣大學者們的重視。而樹舌靈芝多糖（soluble polysaccharides from Ganoderma applanatum，GASP）作為樹舌靈芝的活性成分之一，也受到醫藥工作者的重視，關于其報道也最多。

目前提取多糖常用的方法有水提法、超聲提取法、微波提取法、酶提取法、超臨界流體萃取法、酸提法、堿提法等[12-14]。而水提法是實驗室提取多糖最常用的方法之一，該方法具有經濟環保、操作簡單、對設備要求低等優點。最重要的是與其他方法相比，對天然活性物質的結構影響小，因此被廣泛應用于包括多糖的水溶性活性成分的提取研究[15]。筆者采用熱水提取法對樹舌靈芝多糖（GASP）進行提取，并在提取條件單因素的基礎上進行響應面法優化，以確定水提樹舌靈芝多糖最佳提取工藝，為樹舌靈芝多糖規模化開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樹舌靈芝采至黑龍江省佳木斯市湯原縣鷹山，經佳木斯大學生藥學教研室王麗紅教授鑒定為樹舌靈芝（Ganoderma applanatum）。試驗所用葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

FW135中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）;FA2004N型電子分析天平（上海恒平科學儀器有限公司）;HH-24型恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司）;UV-2550型紫外可見分光光度計（島津公司）。

1.3 方法

1.3.1 樹舌靈芝多糖的提取。

取清洗過后的樹舌靈芝子實體放至烘箱，50 ℃烘干至恒重，粉碎過40目篩，制得樹舌靈芝干粉。精密稱取樹舌干粉3.0 g，用80%乙醇浸泡24 h，乙醇用量剛好沒過料面即可，抽濾，80%乙醇洗脫濾渣至濾液澄清，自然晾干。按試驗方案所需液料比、提取溫度、提取時間、提取次數進行提取，抽濾，離心，濃縮至固定體積，所得溶液即為樹舌靈芝粗多糖提取液。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的繪制。

精密稱取干燥恒重的標準葡萄糖10 mg，定容于100 mL容量瓶中，配制成濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的葡萄糖標準品溶液，分別置于具塞試管中，依次加水定容至2 mL，另取2.0 mL蒸餾水作空白對照。然后加入1.0 mL濃度5%的苯酚溶液，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻后待試管冷卻至室溫即可。在波長490 nm處測定吸光值，以所測吸光值為縱坐標，標準葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并求出線性回歸方程及相關系數。

1.3.3 粗多糖含量及提取率的測定? 。

將所得粗多糖溶液稀釋至適當倍數后得樣品溶液，精密移取樣品溶液2 mL，按測定標準曲線的方法測定吸光度，由回歸方程計算樹舌靈芝粗多糖溶液中多糖的濃度，按下式計算樹舌靈芝粗多糖溶液中多糖的含量：多糖含量（m0）=C·V·X;多糖得率（%）=m0/m×100%。式中，C為樣品溶液中多糖的濃度（mg/mL），V為樣品溶液體積（mL），X為稀釋倍數，m為樹舌靈芝干重（g），m0為多糖含量（mg）。

1.4 單因素試驗設計

1.4.1 液料比對樹舌靈芝多糖提取率的影響。

準確稱取6份質量相同的樹舌靈芝干粉3.0 g，按樹舌靈芝粗多糖提取工藝流程“1.3.1”進行操作，設置液料比為15∶1、25∶1、35∶1、45∶1、55∶1、65∶1（mL∶g，下同），在70 ℃條件下浸提2 h，提取3次，根據所測吸光度考察液料比對樹舌靈芝粗多糖得率的影響。

1.4.2 提取溫度對樹舌靈芝多糖提取率的影響。

準確稱取6份質量相同的3.0 g靈芝干粉末，按樹舌靈芝粗多糖提取工藝流程進行操作，按液料比 45∶1加入蒸餾水，設置提取溫度分別為50、60、70、80、90、100 ℃，浸提2 h，提取3次。根據所測吸光度考察提取溫度對樹舌靈芝多糖提取率的影響。

1.4.3 提取時間對樹舌靈芝多糖提取率的影響。

準確稱取6份質量相同的5 g靈芝干粉末，按液料比45∶1加入蒸餾水，設置提取時間分別為30、60、90、120、150、180 min，在70 ℃條件下提取3次，根據所測吸光度考察提取時間對樹舌靈芝粗多糖得率的影響。

1.4.4 提取次數對樹舌靈芝多糖提取率的影響。

準確稱取6份質量相同的5 g靈芝干粉末，按液料比45∶1加入蒸餾水，設置提取次數分別為1、2、3、4次，在70 ℃條件下浸提2 h。根據所測吸光度考察提取次數對樹舌靈芝粗多糖得率的影響。

1.5 響應面試驗設計

通過單因素試驗確定各因素變量范圍，選擇提取溫度（A）、提取時間（B）及液料比（C）為主要影響因素。運用Design Expert 8.0軟件進行3因素3水平Box-Behnken試驗設計，試驗因素及水平編碼如表1所示。根據公式（1）計算出多元二次回歸數學模型，進行數據回歸分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線線性考察結果

根據葡萄糖對照品濃度（C）與吸光度值（A）的線性關系得回歸方程A=67.428 57C-0.112 19，R2=0.999 5，說明葡萄糖濃度與吸光度值的線性關系良好。

2.2 單因素結果分析

2.2.1 液料比對樹舌靈芝多糖提取率的影響。

由圖1可知，液料比在15∶1～35∶1范圍內，GASP提取率與液料比呈正相關;在35∶1時最大，提取率可達2.18%;而液料比超過35∶1以后，隨著液料比的增大GASP提取率呈下降趨勢。這可能是因為在一定范圍內，隨著液料比的增大可以提高植物細胞內外溶劑的濃度差，從而使水溶性多糖迅速溶出從而提高多糖提取率[16]，但液料比達到一定值后，液料比太大，濃縮時間延長，導致多糖損失[17]。綜合考慮，選擇35∶1為BBD（Box-Behnken Design）試驗液料比的中心點。

2.2.2 提取溫度對樹舌靈芝多糖提取率的影響。

由圖2可知，在一定提取范圍內，GASP提取率隨著提取溫度的升高而增大，提取溫度在80 ℃時GASP提取率最高可達2.05%;提取溫度超過80 ℃以后，隨著溫度的升高GASP提取率呈下降趨勢。這可能因為溫度上升到一定水平時，由溫度過高引起部分多糖結構破壞而降解[18]，從而使GASP提取率降低。因此選擇80 ℃為BBD試驗提取溫度的中心點。

2.2.3 提取時間對樹舌靈芝多糖提取率的影響。

圖3表明，GASP提取率隨著溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，在120 min時達到峰值2.08%。這可能因為處理時間太短，樣料中的多糖不能充分溶解;而時間太長，會使多糖降解為各種單糖，導致提取率下降[19]。因此選擇120 min為BBD試驗提取時間的中心點。

2.2.4 提取次數對樹舌靈芝多糖提取率的影響。由圖4可以看出，GASP提取率隨著提取次數的增加而提高，提取次數從1次增加到3次，GASP提取率從1.13%增加到2.11%，增幅比較明顯，從3次到5次提取率幾乎趨于穩定。綜合考慮，為節約資源，簡化操作，確定BBD試驗提取次數的中心點為3次。

2.3 響應面優化結果分析

2.3.1 Box-Behnken模型建立及試驗結果。

通過響應面設計Box-Behnken對GASP提取率建立數學模型，優化提取工藝參數，共有17個試驗點，12個分析因子，5個零點。以分析因子為自變量在A、B、C構成三維頂點;零點為區域的中心點。零點試驗重復5 次，用以估算試驗誤差[20]。以GASP提取率為響應值，試驗結果見表2。

2.3.2 響應面回歸模型的建立及顯著性檢驗。

運用Design-expert 8.0軟件對表2中的GASP提取率進行回歸分析，建立回歸模型。根據公式（1），得GASP提取率回歸方程（編碼方程）為：Y=2.54+0.10×A+0.38×B-0.32×C-0.12×A×B+0.33×A×C-0.23×B×C-0.38×A2-0.50×B2-0.36×C2。

模型的F值為49.3 P<0.000 1**，表明該試驗所得擬合方程回歸模型具有高度顯著性。失擬項P>0.05，不顯著，表明該模型的穩定性較好;調整決定系數R2=0.984 5，表明GASP提取率約98.45%是由獨立變量決定;決定系數R2Adj=0.964 5，變異系數C.V.%=5.50%，表明該模型的相關性高，擬合度較好，能很好地模擬GASP真實提取率與各變量之間的關系。概率值P<0.05說明該模型項是顯著的;P<0.01說明該模型項為極其顯著。根據回歸模型方差分析可知：FA=7.18，PA=0.031 5*;FB=98.06，PB<0.000 1**;FC=68.21，PC<0.000 1**;FAB=4.99，PAB=0.060 7;FAC=37.67，PAC=0.000 5**;FBC=18.54，PBC=0.003 5**;FA2=51.54，PA2=0.000 2**;FB2=89.46，PB2=0.000 1**;FC2=46.77，PC2=0.000 2**。可見，A為顯著項;B、C、AC、BC、A2、B2 、C2均為極顯著項。

2.3.3 等高線圖及響應面圖分析。

為比較直觀地了解各因素之間交互作用是否顯著，以期進一步優化試驗工藝，運用Design-expert 8.0軟件對GASP提取率響應值分析作圖，得到由響應值、A、B、C因素所構成的三維空間圖及其三維空間在二維平面上的等高線圖，分析結果見圖5～7。

由圖5中的三維空間圖可知，該試驗在所選范圍內存在極值，既是三維曲面的最高點，又是等高線圖橢圓的中心點。與A方向比較，B方向的效應面曲線較陡，B等高線的密度顯著高于沿A方向移動的密度，說明提取時間（B）對GASP提取率的影響顯著高于提取溫度（A）;等高線呈圓形，表明提取時間（B）與提取溫度（A）的交互作用不顯著。

由圖6可以看出，與A方向比較，C方向的效應面曲線較陡，C等高線的密度顯著高于沿A方向移動的密度，說明液料比（C）對GASP提取率的影響顯著高于提取溫度（A）;等高線呈橢圓形，表明液料比（C）與提取溫度（A）的交互作用顯著。

由圖7可以看出，與C方向比較，B方向的效應面曲線較陡，B等高線的密度顯著高于沿C方向移動的密度，說明提取時間（B）對GASP提取率的影響顯著高于液料比（C）;等高線呈橢圓形，表明提取時間（B）與液料比（C）的交互作用顯著。因此，各因素對GASP提取率影響大小為提取時間（B）>液料比（C）>提取溫度（A）。

2.3.4 響應面模型驗證。

根據所得到的模型，預測最佳提取工藝條件為提取溫度77.04 ℃、提取時間137.91 min、液料比27.33∶ 在該條件下GASP提取率的理論值可達2.76%。考慮到試驗的實際操作性，將提取條件修正為提取溫度77 ℃、提取時間138 min、液料比27∶1。試驗重復3次，所得GASP實際提取率為2.57%±0.05%，該結果與理論值較為吻合。

3 結論

該研究在單因素試驗的基礎上，運用Box-Benhnken響應面法對樹舌靈芝多糖的提取條件進行優化，結果表明：提取溫度、提取時間、液料比均對樹舌靈芝多糖提取率有顯著影響，影響大小為提取時間>液料比>提取溫度;最終確定樹舌靈芝多糖提取的最佳工藝條件為提取溫度77 ℃、提取時間138 min、液料比27∶ 在該條件下多糖實際提取率為2.57%±0.05%。可見，運用響應面法優化樹舌靈芝多糖提取工藝參數切實可靠，為樹舌靈芝多糖的開發利用奠定了理論基礎。

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