血紅蛋白Bart′s水腫胎兒綜合征誘導多能干細胞系的建立

冼業星 嚴金梅 陳玉嫦 李東至 孫筱放

1廣州醫科大學附屬第三醫院，廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室，廣東省產科重大疾病重點實驗室（廣州510150）；2廣州醫科大學附屬廣州市婦女兒童醫療中心，產前診斷中心（廣州 510623）

地中海貧血（thalassemia，簡稱地貧）又稱海洋性貧血，是臨床常見的一組珠蛋白生成障礙性常染色體隱性遺傳性疾病。因其最早在意大利、希臘、馬耳他等地中海沿岸國家發現而得名，該種疾病在東南亞、地中海等地區較為常見。根據珠蛋白基因缺陷的不同分類，而以α地中海貧血和β地中海貧血兩種分型最為常見。其中α-地中海貧血是一組以珠蛋白合成減少，α-鏈/非α-鏈比例失衡為特征的遺傳性溶血性血紅蛋白病。在我國南方α-地中海貧血的高發區中，廣西、廣東、江西、四川和浙江各省的發病率分別為14.95%、4.11%、2.6%、1.92%和1.20%［1］。雖然產前診斷技術飛速發展，但是我國每年仍有不少的α-地貧患兒出生。血紅蛋白 Bart′s（Hb Bart′s）水腫胎兒綜合征是a-地中海貧血純合子型，是罕見的新生兒或胎兒嚴重溶血的致死型，自1960年起國內外就開始有陸續報道［2］。正常人有4個α基因，即αα/αα，當 4 個α基因缺失時??/??即為Hb Bart′s胎兒水腫綜合征。最常見的缺失型如東南亞缺失型（??SEA）全部缺失了兩個α基因，即當一對夫婦均為此型時，則胎兒有1/4機會遺傳有Bart氏綜合征風險。患者在胎兒時期就出現了大量γ鏈合成γ4，因其對氧的親合力極高，導致組織缺氧而造成胎兒水腫綜合征，孕婦常在妊娠30～40周時便出現流產、死胎或者胎兒在娩出后30 min內死亡。東南亞缺失等位基因在華南地區人群中達4%～8%，而在泰國北部甚至高達14%［3-4］。

誘導多能干細胞（iPS）技術在2006年［5］出現，并在近幾年發展迅速，為再生醫學研究提供了一個理想的研究及治療模型。近年來，科學家們利用誘導多能干細胞分化的特性來進行向各種體細胞的分化以探討疾病發病機制和治療，如神經細胞和造血細胞等［6-7］。而目前通過使用Hb Bart′s胎兒水腫綜合征疾病來源的誘導多能干細胞作為材料進行該病相關機制及治療研究尚未報道，因此本研究通過收集Hb Bart′s胎兒水腫綜合征孕婦羊水細胞，利用仙臺病毒來誘導建立誘導多能干細胞系，評估相關干細胞多能性，為下一步治療研究提供理想的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑細胞培養皿、15/50 mL離心管和凍存管（Corning），羊水培養基（AmnioMAX?TM?Ⅱ），PCR擴增試劑盒（北京天根），Knockout DMEM培養液、Knockout血清替代培養物、NEAA、GlutamaxTM 和 P/S（GIBCO），bFGF（Peprotech），Cy?toTune??iPS 2.0 Sendai重編程試劑盒（Life）、Trizol試劑（Invitrogen），PBS，mTeSR1（Stem cell），EDTA，胰酶，TritonX?100，DAPI染液（ROCHE），AP 染色試劑盒（上海斯丹賽），實驗用引物（上海捷瑞），抗體OCT4、SSEA4、TRA?1?81、SMA和AFP（Abcam），抗體SOX2、Nestin（ABGENT）。

1.2 儀器與設備激光共聚焦顯微鏡、倒置顯微鏡和體視顯微鏡（Nikon），臺式離心機（Eppendorf），恒溫水浴箱（Memmert），生物安全柜、移液槍、培養箱和-80℃冰箱（Thermo），PCR儀（ABI），電泳儀和凝膠成像分析儀（Bio?Rad），液氮罐（MVE），4/-20℃冰箱（Haier）。

1.3 羊水細胞的采集和培養胎兒診斷為純合性α-地中海貧血（??SEA/??SEA）的孕婦獲得知情同意之后，在妊娠16周時在超聲引導下進行羊膜穿刺術，抽取10 mL羊水，通過1 000 r/min離心5 min收集羊水細胞。棄上清，將細胞懸浮于4 mL羊水培養基中，將其轉移至6 cm培養皿中放置于含有5%CO2的37℃潮濕的培養箱中培養。7～8 d后更換4 mL新鮮的培養基。在細胞達到80%～90%融合時進行細胞傳代培養，使用適量0.05%胰蛋白酶進行消化，并以1∶4的比例傳代到相對應的培養皿中進行擴增培養。

1.4 誘導多能干細胞建系筆者使用CytoTune??iPS 2.0仙臺重編程試劑盒通過仙臺病毒轉染系統將四種轉錄因子 OCT4，SOX2，KLF4 和 c?Myc（OSKM）轉入血紅蛋白Bart′s患者羊水細胞中。如圖1所示，轉導24 h后更換新鮮羊水培養基，后每隔一天更換新鮮培養基。轉導后第7天時將其消化接種到提前準備滅活的小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）飼養層上。第8天后開始換液更換為新鮮的iPS培養基，以后每天更換新鮮的iPS培養基培養，并觀察克隆形成。待克隆長大后以機械切割的方式將其傳代擴增，將得到的克隆吸到用matrigel覆蓋的無菌培養皿中用mTeSRTM1繼續培養，前1～3代時待克隆長大后以機械切割的方法傳代擴增以去除分化的細胞，得到純化的iPSc后可使用EDTA進行消化傳代擴增及凍存。

1.5 iPSC多能性檢測

1.5.1 堿性磷酸酶檢測將細胞按1∶6～7比例傳代以稀釋細胞密度，4～6 d后使克隆長大后克隆之間有足夠間距以便于染色觀察。細胞足夠大后用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定10 min。再用PBS洗滌3次，加入堿性磷酸酶染色液在室溫下避光孵育30 min。最后用PBS洗滌顯微鏡下觀察結果。

1.5.2 免疫細胞化學染色細胞系使用4孔板上培養3～4 d后用4%多聚甲醛固定20 min，然后用PBS洗滌2次，使用透膜液0.1%的TritonX?100透膜20 min，加2%FBS?PBS室溫封閉1 h。用PBS洗滌細胞，細胞與混有OCT4（1∶200）、SSEA4（1∶100）、SOX2（1/100）和TRA?1?81（1∶200）的一抗在4 ℃下孵育過夜后，用PBS清洗3遍，再與相應二抗在37℃下避光孵育2 h，用PBS清洗3遍后用DAPI染細胞核，共聚焦顯微鏡進行熒光拍照。

1.5.2 RT?PCR檢測多能性基因表達使用Trizol提取已建成的誘導多能干細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，RT?PCR檢測誘導性多能干細胞中胚胎干細胞標志性基因SOX2、NANOG、LIN28和OCT4的表達情況，用胚胎干細胞H1細胞系作為陽性對照，羊水細胞作為陰性對照。PCR反應程序設置：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環擴增36次，最后72℃延伸7 min，得到的PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.5.3 誘導性多能干細胞擬胚體形成實驗誘導性多能干細胞經1 g/L的Dispase消化成細胞團塊后，用擬胚體分化液重懸，鋪在低吸附的培養皿中，放置在37℃繼續懸浮培養，隔天換液，觀察擬胚體形成情況。1周后將擬胚體轉移到0.1%明膠包被的細四孔板胞培養皿中繼續培養。1周后，進行免疫熒光化學染色，其中外胚層的標記物為Nestin，中胚層的標記物為SMA，內胚層的標記物為AFP，在共聚焦顯微鏡進行熒光拍照。

1.5.4 免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成試驗檢測iPSCs的體內分化潛能當在matrigel包被的無菌培養皿上培養的iPSCs生長至70%的密度時，用dispase消化酶消化7 min，用1 mL槍頭將細胞團吹脫，用約100 μL的DMEM/F12和Matrigel混合液（1∶1）重懸細胞，在每只免疫缺陷性（SCID）小鼠的后大腿內側下注射收集的細胞106個細胞，大約8～10周后，當小鼠腿部的腫塊直徑超過2 cm時處死小鼠分離腫塊。腫塊在福爾馬林中固定過夜，石蠟包埋并進行切片，使用蘇木精伊紅（HE）染色，最后顯微鏡下觀察3個胚層的形成情況并拍照記錄。

1.6 核型分析取傳代后3～4 d的iPSCs，加入0.25 mg/L秋水仙素，37℃孵育3 h。用0.05%胰酶把iPSCs消化成單細胞，1000 r/min離心5 min收集細胞，0.4%枸櫞酸鈉：0.4%KCl=1∶1的低滲液37℃下處理5 min；加入7滴新鮮配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3∶1）進行預固定，1 000 r/min離心5 min，棄上清，再加固定液，室溫繼續固定40 min；離心棄上清，加入200 μL的固定液后重懸細胞，進行滴片，使用吉姆薩染色10 min，用水輕輕沖洗，在室溫下風干，在顯微鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 轉錄病毒誘導SCA3皮膚成纖維細胞產生誘導多能干細胞在轉導后11～14 d出現胚胎干細胞樣克隆（圖2B）。轉導后第21～22天（圖2C），克隆足夠大時，在顯微鏡下用機械法將獨立克隆切開，選擇典型的克隆挑取至鋪有matrigel的4孔板中，每個克隆接種到1個孔內并用mTeSRTM1培養基培養，并記作P1代。適量擴增及凍存各個代次細胞。Hb Bart′s水腫胎誘導多能干細胞形態特征（圖2D）與人胚胎干細胞相似，細胞克隆呈扁平、致密，邊界明顯，核質比例較大。

圖1 羊水細胞重編程示意圖Fig.1 Flow chart of amniotic fluid cell reprogramming

圖2 重編程前后細胞形態Fig.2 Cell morphology before and after reprogramming

2.2 Hb Bart′s水腫胎誘導多能干細胞iPSCs保留多能性及體外分化潛能本研究建立誘導的多能干細胞堿性磷酸酶染色呈陽性（圖3），表明誘導后細胞表達高水平的堿性磷酸酶。

誘導多能干細胞進行多能干細胞的標志物SSEA4，TRA?1?81，SOX2和OCT4均陽性，DAPI為核染顯示藍色熒光（圖4）。

圖3 堿性磷酸酶染色（Bar=100 μm）Fig.3 Alkaline phosphatase staining（Bar=100 μm）

圖4 誘導多能干細胞多能性表面特異性標志物Fig.4 Pluripotent surface?specific markers of iPS

RT?PCR結果顯示誘導多能干細胞表達人胚胎干細胞多能性標志基因SOX2、NANOG、LIN28和OCT4（圖5）

誘導多能干細胞通過自發分化形成擬胚體（圖），并可形成表達Nestin（外胚層，圖6A）、SMA（中胚層，圖6B）和AFP（內胚層，圖6C）3個胚層。

圖5 RT?PCR 檢測細胞系中 SOX2、NANOG、LIN28和OCT4基因表達Fig.5 Detection of the gene expression of SOX2，NANOG，LIN28 and OCT4 in cell lines by RT?PCR

圖6 三胚層分化Fig.6 Differentiation of three germ layer

誘導多能干細胞注射到免疫缺陷小鼠8～10周后發現腹股溝處出現腫瘤。對畸胎瘤組織進行切片并HE染色表明，所形成的腫瘤存在包括有外胚層、中胚層和內胚層三個胚層分化的組織（圖7）。

此外，筆者還對誘導多能干細胞進行核型分析（圖8），其在體外長期培養后仍能維持正常的二倍體核型。

3 討論

近幾年誘導多能干細胞（iPS）技術的迅速發展，為再生醫學研究提供了獲得病人自身體細胞來源的多能性干細胞的體外培養途徑，不但避免了外源細胞引起自身免疫排斥問題，而且規避了臨床上的倫理問題。經過科學家們這幾年的研究，已經成功建立起多種疾病病人特異性的iPS細胞系［8］。正是iPSc技術的發展，科學家們逐漸將其應用到疾病治療方向上，如應用這種技術來治療β地中海貧血取得重大進展，通過對自身iP?Sc進行修復，并最終使細胞能夠表達相應的HBB蛋白［9-13］。但筆者同時也要看到iPS疾病模型的不足，如建成細胞所需要的時間成本及所用的轉導方式介質對其后續的治療影響均需要考慮。

圖8 誘導多能干細胞核型Fig.8 Karyotypes of iPS

仙臺病毒為非整合方法，對于基因組來說是一種產生iPSC的安全方法，且相對其他誘導方法更為高效［14-15］。筆者通過使用仙臺病毒從Hb Bart′s的胎兒的人羊水細胞中建成了誘導多能干細胞，并對建立的干細胞進行了相關多能性檢測。堿性磷酸酶（AP）活性通常在胚胎干細胞等全能或多能干細胞表現較高，當胚胎細胞發生分化后，AP活性隨之降低，而筆者的細胞堿性磷酸酶染色結果呈陽性。另外，免疫熒光檢測也是干細胞多能性常用的典型檢測方法，如干細胞表面特異性標志物如SSEA4，TRA?1?81，SOX2和OCT4等，所建立的iPS均為陽性。同時對誘導多能干細胞的多能性標志基因SOX2、NANOG、LIN28和OCT4表達進行RT?PCR檢測亦提示為陽性。筆者還對細胞進行體外和體內分化能力進行了評估，通過自發分化EB和畸胎瘤形成實驗，均形成外胚層、中胚層和內胚層3個胚層，提示其分化的全能性。為了驗證所產生的細胞是否有變異，本研究對細胞進行了核型分析，結果顯示仍維持正常的二倍體核型。從筆者的實驗結果可以看到，均提示筆者成功建立了Bart′s水腫胎兒綜合征誘導多能干細胞。

α-地貧在我國南方地區為最常見的遺代傳病之一，特別是Hb Bart′s為致死性疾病，目前尚無根治方法，而只有通過產前診斷來進行預防性干預，一旦發現即選擇終止妊娠處理，若要治療這種疾病可能需要進行宮內治療。隨著基因治療方法策略的發展［10，16-17］，結合誘導多能干細胞技術，可以用其來研究對應疾病的病理機制，同時可為個體化治療方案提供基礎，利用修復遺傳病突變基因，獲得胎兒正常的iPS細胞，有望利用iPS技術對胎兒進行宮內治療以減少出生缺陷所帶來的巨大經濟和精神負擔。有了Hb Bart′s水腫胎兒綜合征細胞模型，將為筆者下一步探討該疾病研究及治療工作提供重要工具，可以先在細胞層面上進行探究以減少直接對病人試驗所帶來的傷害。

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