3，4?二羥基苯乙酮抑制NF?κB核轉位減輕脂多糖誘導巨噬細胞炎癥反應

張代娟 劉江月 王建英

濰坊醫學院病理生理教研室（山東濰坊261053）

動脈粥樣硬化（AS）是一種慢性炎性疾病［1］。巨噬細胞參與了AS發生發展的整個過程（脂質條紋、斑塊形成及破裂）。活化的巨噬細胞氧化活性增強，釋放多種炎癥介質，可通過胞內炎性信號通路擴大炎癥反應。NF?κB的活化是一個中心環節。NF?κB核易位而具有活性，調控與AS炎癥反應相關的多種因子的轉錄和表達，參與AS炎癥反應［2］。因此，從不同環節尋找抑制NF?κB活性的藥物，用于治療和預防與NF?κB有關的疾病，是當前藥物研究的熱點。而挖掘祖國醫學，從中草藥及其提取物中開發價廉、服用方便且能有效防治AS發生發展的藥物已凸顯明顯的優勢。3，4?DHAP是從禿毛冬青葉中提取的單體成分，具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒等作用［3］。本課題組前期研究發現3，4?DHAP能抑制巨噬細胞的炎癥反應［4］，并降低兔血漿TNF?α及減少兔AS斑塊中VCAM?1的表達，具有抗炎作用［5］。但其抗炎機制尚不明確，目前國內外研究較少。因此，本研究以NF?κB信號通路為切入點，以巨噬細胞為研究對象，探討3，4?DHAP抗炎的可能機制，有助于我們更全面地了解3，4?DHAP藥理機制，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑RAW264.7購自中國科學院上海細胞所；3，4?DHAP（純度99.9%）日本TCI，批號：D2345?5G。LPS、Western blot相關試劑（SANTA CRUZ）；TNF?α、VCAM?1 ELISA試劑盒及一抗（武漢博士德生物工程有限公司）；IκB qRT?PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司），P?IκB、IκB多克隆抗體（美國RabMAb公司）；NF?κBp65多克隆抗體（美國Abcam公司）。

1.2 主要儀器CO2培養箱（美國Thermo Forma公司）；DYCZ?25D型電泳儀（北京市六一儀器廠）；Bio?Rad濕轉儀、CFX96TMReal?Time PCR 儀（美國Bio?Rad公司），凝膠成像分析儀（美國Biorad公司）。

1.3 細胞培養及分組37℃、5%CO2培養箱，DMEM培養基傳代培養RAW264.7細胞。隨機分為正常組（A）、LPS組（B）、3，4?DHAP組（C）、辛伐他汀組（D）。LPS終濃度10 ng/mg，3，4?DHAP終濃度10?7mol/L，辛伐他汀終濃度10-7mol/L［6］。LPS 刺激8 h后［6］，收集細胞及上清液。

1.4 ELISA檢測TNF?α、VCAM?1的水平采用雙抗體夾心法，按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.5 qRT?PCR檢測IκB mRNA表達收集處理后的細胞，提取總RNA，去除基因組DNA后進行RNA逆轉錄反應，以β?actin為內參進行RT?PCR反應，計算目的RNA的相對表達量，引物設計見表1。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of the primers

1.6 Western blot檢測P?IκB、IκB及NF?кB P65蛋白的表達收集處理后RAW264.7細胞，提取總蛋白，SDS?PAGE凝膠電泳分離蛋白后切取目的條帶，以濕轉法進行轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加Ⅰ抗（1：500），4℃過夜，TBST漂洗3× 15 min，加入Ⅱ抗孵育1 h，TBST漂洗3×15 min，ECL化學發光，暗室曝光顯影，圖像分析。

1.7 Western blot檢測細胞核內NF?кB P65蛋白表達參照文獻［7-8］報道的方法提取核蛋白，Western blot法同上。

1.8 統計學方法實驗數據以表示，應用SPSS 18.0統計學軟件進行分析，采用單因素方差分析，組間比較用LSD檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNF?α、VCAM?1的分泌與A組比較，B組TNF?α、VCAM?1分泌顯著增多（P＜ 0.05）；與B組比較，C、D 組TNF?α、VCAM?1分泌均顯著減少（P＜0.05），且C組較D組減少顯著（P＜0.05），說明3，4?DHAP對LPS誘導RAW264.7細胞TNF?α、VCAM?1分泌有明顯的抑制作用，且作用效果優于辛伐他汀（圖1）。

圖1 TNF?α、VCAM?1的分泌Fig.1 The secretion of TNF?α and VCAM?1

2.2 IκB、P?IκB蛋白的表達與A組比較，B組P?IκB/IκB比值顯著增加（P＜ 0.05）；與B組比較，C、D組P?IκB/IκB比值均明顯減少（P＜ 0.05），且C組較D組減少明顯（P＜0.05），說明3，4?DHAP對LPS誘導RAW264.7細胞IκB蛋白磷酸化有明顯的抑制作用，且作用效果好于辛伐他汀（圖2）。

2.3 IκB mRNA的表達與A組比較，B組IκB mRNA表達顯著減少（P＜0.05）；與B組比較，C、D組IκB mRNA表達均明顯增加（P＜0.05），且C組較D組表達更加顯著，差異有顯著性（P＜0.05），說明3，4?DHAP促進LPS誘導RAW264.7細胞IκB mRNA表達，且作用效果優于辛伐他汀（圖3）。

圖3 IκB mRNA 的表達Fig.3 The expression of IκB mRNA

2.4 NF?κBp65蛋白核轉位與A組比較，B組細胞核內NF?κB蛋白表達明顯增多（P＜0.01）；與B組比較，C、D組細胞核內NF?κB蛋白表達均顯著減少，且C組較D組減少更為明顯，差異有顯著性（P＜0.05），說明 3，4?DHAP抑制 LPS誘導RAW264.7細胞NF?κB核轉位，且作用效果優于辛伐他汀（圖4、5）。

圖4 細胞核NF?κBp65蛋白表達Fig.4 The expression of nuclear NF?κBp65 protein

3 討論

AS是眾多心腦血管疾病共同的基本病理過程，對人類健康造成嚴重危害，尋找有效防治藥物已成為醫藥界的重要任務。巨噬細胞是動脈粥樣硬化病變的主要細胞，是動脈粥樣硬化病變進展的一個特征。活化的巨噬細胞釋放多種炎癥介質，擴大炎癥反應，推動動脈粥樣硬化的發展［9］。3，4?DHAP是本課題組致力研究多年的一種藥物。本研究通過LPS誘導RAW264.7細胞發現上清液中TNF?α、VCAM?1水平均明顯升高，而3，4?DHAP對TNF?α、VCAM?1分泌有明顯的抑制作用，說明3，4?DHAP可以抑制活化的巨噬細胞所介導的炎癥反應，這與本課題組在前期工作中發現 3，4?DHAP 具有抗炎作用的結果［4］是一致的。

圖5 細胞質NF?κBp65蛋白表達Fig.5 The expression of cytosolic NF?κBp65 protein

研究表明，NF?κB信號通路參與慢性炎癥的反應過程，如動脈粥樣硬化、風濕性關節炎等［10］。NF?κB是一種重要的核轉錄因子，對多種促炎癥細胞因子、黏附分子、趨化因子的表達起著關鍵的調控作用［11］。例如 IL?1，6，8，TNF?α，ICAM?1，VCAM?1等，這些基因的啟動子和增強子中存在一個或多個κB序列，因此，NF?κB的激活是這些基因活化的前提，是形成AS的前提［12］。IκB激酶是NF?κB核轉位的關鍵酶，在正常細胞中，NF?κB與抑制因子IκB結合以無活性的狀態存在于細胞漿中，當細胞受到氧化應激等因素刺激時，IκB磷酸化降解，NF?κB迅速從細胞漿易位到細胞核，與相應基因的κB位點結合，上調這些基因的轉錄活性及蛋白表達［13］。YU等［14］研究發現抑制NF?κB活性可明顯降低LPS誘導RAW264.7細胞TNF?α、IL?1的表達。李旎等［15］研究發現抑制IκB磷酸化，下調NF?κB活性，能明顯減少LPS誘導RAW264.7細胞TNF?α分泌。本研究發現LPS誘導RAW264.7細胞核內NF?κB蛋白含量明顯增多，3，4?DHAP干預后，IκB蛋白表達顯著增加，細胞核內NF?κB蛋白含量明顯減少，表明NF?κB核轉位明顯受到抑制，同時上清中TNF?α、VCAM?1水平顯著降低，表明抑制NF?κB核轉位可減輕炎癥反應，與前人的研究結果一致。

總之，本研究證實了3，4?DHAP對LPS誘導RAW264.7細胞分泌TNF?α、VCAM?1具有明顯的抑制作用，3，4?DHAP通過抑制NF?κB核轉位，有效抑制LPS誘導RAW264.7細胞炎癥反應。

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