Wnt/β?catenin信號通路在腎缺血再灌注大鼠中的表達及ICG?001阻斷對慢性腎間質纖維化的作用

黃健 劉暢 陳松 閔亞麗

貴陽市第一人民醫院腎內科（貴陽550002）

腎缺血再灌注損傷（IRI）是在腎組織缺血基礎上恢復血液灌流后腎臟功能不能得到有效恢復，甚至出現不可逆的腎臟功能損害，是多種腎臟疾病發展的重要環節。IRI的損傷機制較復雜，有多重信號通路參與調控，其發病機制尚未完全清楚，目前尚未發現很有效的干預措施。有研究發現IRI引起急性腎損傷時Wnt/β?catenin信號通路被激活，并可能參與了腎小管上皮細胞的修復［1］，而Wnt/β?catenin信號通路在IRI致慢性腎間質纖維化的研究甚少。本研究觀察不同時間Wnt/β?catenin信號通路在IRI致腎小管間質纖維化大鼠中的表達，并用β?catenin的小分子抑制劑ICG?001阻斷Wnt/β?catenin信號通路，觀察腎臟的病理變化，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立和分組選用雄性SD大鼠28只（購自貴州醫科大學動物實驗中心），隨機分為Sham組、IRI 7 d組、IRI 14 d組、ICG+IRI組（n=7）。以5%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉。IRI 7 d、IRI 14 d組及ICG+IRI組游離后用無創血管夾夾閉左側腎動脈，35 min后去除血管夾，縫合傷口。Sham組游離左側腎動脈但不夾閉。ICG+IRI組于術后第2天開始腹腔注射ICG?001［5 mg/（kg·d），上海佰世凱］。IRI 7 d組術后6 d切除右腎，術后7 d處死大鼠；其余3組大鼠術后13 d切除右腎，術后14 d處死大鼠。處死前腹主動脈取血，分離血清。留取左腎組織部分置于4%甲醛溶液固定，部分放入-80℃低溫凍存冰箱。

1.2 腎功能測定全自動生化儀測定血清肌酐濃度。

1.3 生化染色法檢測采用天狼猩紅/快速綠色膠原染色試劑盒（Chondrex Inc）檢測膠原含量。10 μm厚冰凍切片，按試劑盒說明書操作，計算膠原量所占百分比。

1.4 腎臟組織學檢查腎組織經10%中性緩沖甲醛過夜，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度3 μm）后，Masson染色分析。

1.5 腎臟免疫組織化學采用ABC法檢測β?catenin的表達。石蠟切片常規脫蠟，3%H2O2室溫孵育10 min，浸入檸檬酸鹽緩沖液微波修復20 min，牛血清封閉20 min，加β?cateninⅠ抗（Santa Cruz）4℃孵育過夜。Ⅱ抗孵育1 h后加入ABC復合物，暗室孵育30 min，沖洗后加入顯色液，顯色10～30 min，顯微鏡下觀察，蘇木素襯染，封片。

1.6 Western blot檢測提取腎臟總蛋白并用BCA法進行蛋白質定量，每泳道30 μg蛋白，10%SDS?PAGE電泳分離后濕轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后，分別加Tubulin（上海康成，1∶10 000）、多克隆鼠抗β?catenin（Santa Cruz，1∶2 000）、Fibro?nectin（Santa Cruz，1∶1 000）、α?SMA（Santa Cruz，1∶10 000），Ⅰ抗4℃孵育過夜。洗膜后，再加辣根過氧化酶標記的Ⅱ抗。用增強化學發光系統顯色，并曝光于X光膠片上，計算機圖像分析系統分析條帶的相對吸光度值。

1.7 統計學方法用SPSS 12.0軟件對數據進行統計學處理，所有數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK?q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清肌酐Sham組與IRI 7 d組肌酐差異無顯著性（P＞0.05），IRI 14 d組肌酐明顯高于Sham組與IRI 7 d組（P＜0.05），ICG+IRI組血清肌酐較IRI 14 d組降低（P＜0.05），見表1。

2.2 膠原含量Sham組與IRI 7 d組膠原含量無明顯差異（P＞0.05）；與Sham組及IRI 7 d組相比，IRI 14 d組膠原含量明顯增多（P＜0.05）；ICG+IRI組與IRI 14 d組相比膠原含量明顯減少（P＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠血清肌酐、膠原的比較Tab.1 The comparison of serum creatinine and collagen in four groups ±s

表1 4組大鼠血清肌酐、膠原的比較Tab.1 The comparison of serum creatinine and collagen in four groups ±s

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與IRI 7 d組相比，△P＜0.05；與IRI 14 d組相比，#P＜0.05

組別Sham組IRI 7 d組IRI 14 d組ICG+IRI組Scr（mg/dL）0.352±0.085 0.437±0.059 0.897±0.058*△0.634±0.088*#膠原（%）3.843±0.620 5.028±0.852 12.014±0.921*△7.952±0.519*#

2.3 腎臟組織Masson染色觀察IRI 7 d組與Sham組相比無明顯改變（P＞0.05）；IRI 14 d組腎小管上皮細胞腫脹，間質區增寬、部分膠原纖維沉積，少量炎性細胞浸潤，腎間質纖維化。而ICG+IRI組與IRI 14 d組相比病理改變減輕（P＜0.05）。見圖1。

2.4 β?catenin免疫組化Sham組β?catenin在腎間質只有少量表達。IRI 7 d組與Sham組相比β?catenin表達增多（P＜0.05）。IRI 14 d與IRI 7 d組相比，β?catenin在腎間質表達數量明顯增多（P＜0.05）。ICG+IRI組與IRI 14 d組相比，β?catenin在腎間質表達數量明顯減少（P＜0.05）。見圖2。

圖1 4組大鼠Masson病理改變（×400）Fig.1 The pathological changes in four groups（Masson Stain，× 400）

圖2 4組大鼠免疫組化比較（×400）Fig.2 The immunohistochemical expression in four groups（× 400）

2.5 Western?blot測 Fibronectin、β?catenin、α?SMA的蛋白表達水平Sham組β?catenin、Fibro?nectin、α?SMA僅有微量表達。IRI 7 d組β?catenin較Sham組有所增高（P＜0.05），IRI 14 d組β?catenin較IRI 7 d組增高更加顯著（P＜0.05）。Sham組與IRI 7 d組Fibronectin、α?SMA表達無顯著差異。與Sham及IRI 7 d組相比，IRI 14 d組Fibronectin、α?SMA蛋白表達水平明顯上升（P＜0.05）。與IRI 14 d組相比，ICG+IRI組β?catenin、Fibronectin及α?SMA蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖3、表2。

圖3 各組大鼠Fibronectin、β?catenin、α?SMA蛋白表達Fig.3 The expression of fibronectin，β?catenin and α?SMA in four groups

3 討論

既往IRI的大部分研究集中在急性腎損傷，其致慢性腎小管間質纖維化的作用機制研究很少。較輕度的IRI會導致急性腎損傷，而重度的IRI則會出現腎間質成肌纖維細胞激活、細胞外基質沉積導致腎間質纖維化［2］。急性腎損傷有時可以通過適應性修復和再生完全恢復其結構及功能，但有時因適應不良導致病情進展成慢性腎臟病［3］。嚴重IRI所誘發的小管間質病變會進展為慢性小管間質纖維化，并伴隨腎小管濃縮功能的下降和蛋白尿的發生［4］。避免腎小管間質損傷，防止不可逆病理損害的進展是臨床急需解決的問題，近期研究發現還原型谷胱甘肽、七氟醚等處理對IRI腎臟有一定保護作用［5-6］。

表2 4組大鼠β?catenin、α?SMA、Fibronectin的蛋白水平比較Tab.2 The protein assessment of β?catenin，α?SMA and fibronectin in four groups ±s

表2 4組大鼠β?catenin、α?SMA、Fibronectin的蛋白水平比較Tab.2 The protein assessment of β?catenin，α?SMA and fibronectin in four groups ±s

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與IRI 7組相比，△P＜0.05；與IRI 14組相比，#P＜0.05

組別Sham組IRI 7 d組IRI 14 d組ICG+IRI組β?catenin 0.425±0.124 0.783±0.087*1.153±0.142*△0.723±0.152*#α?SMA 0.589±0.096 0.686±0.054 1.997±0.125*△1.212±0.156*#Fibronectin 0.304±0.085 0.418±0.076 0.958±0.096*△0.627±0.088*#

盡管在正常成人腎臟是沉默狀態，但在多種腎損傷中 Wnt/β?catenin 信號通路重新激活［7-8］。近來的研究發現Wnt/β?catenin信號通路在急性腎損傷中激活可以促進腎小管的修復及再生以保護腎臟，但其持續激活則有可能促進急性腎損傷向慢性腎臟病的進展［2，9］。本研究也發現IRI術后7 d腎間質纖維化尚不明顯時，腎組織β?catenin即有增高，隨著時間延長，術后14 d β?catenin增高更加顯著，提示IRI致腎纖維化過程中Wnt/β?catenin信號通路激活，且早于腎間質纖維化出現之前。

本研究觀察到：IRI術后14 d大鼠血肌酐明顯升高，病理改變提示腎小管間質纖維化；Fibronec?tin、α?SMA的蛋白表達及膠原蛋白水平明顯升高。用小分子抑制劑ICG?001阻斷Wnt/β?catenin信號通路，β?catenin表達顯著減少，Fibronectin、α?SMA的蛋白表達水平明顯降低，膠原蛋白及血清肌酐水平也明顯下降，腎小管間質纖維化的病理改變程度有所減輕。但在IRI所致的AKI到CKD的病程進展中Wnt/β?catenin信號通路何時出現從腎臟保護作用到致病作用的轉化以及何時對該信號通路進行干預效果最佳尚缺乏多個時間點的連續性動態觀察，我們在今后的研究中會進一步探討。

總之，本研究觀察到在IRI致慢性腎損傷的病程中，Wnt/β?catenin信號通路早于腎間質纖維化出現前就已激活，參與了慢性腎臟病的發生發展，誘導了腎小管間質纖維化。而用ICG?001阻斷Wnt/β?catenin信號通路可以減輕IRI所致慢性腎間質纖維化，為臨床上探索使用能抑制Wnt/β?catenin信號通路的藥物以防治腎缺血再灌注致慢性腎纖維化提供了理論依據。

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