吳丹丹, 丁時(shí)楨, 路國(guó)濤, 肖煒明, 龔衛(wèi)娟

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室, 江蘇 揚(yáng)州, 225001;2. 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 消化科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

血管生成素樣蛋白(ANGPTL)是由Kim等于2000年首先發(fā)現(xiàn)的具有多功能的信號(hào)蛋白，與人血管生成素結(jié)構(gòu)具有相似性。ANGPTL 4是ANGPTL家族重要成員之一，又被稱為禁食誘導(dǎo)脂肪因子(FIFA)、過氧化物酶體增殖物激活型受體(PPAR)調(diào)節(jié)靶標(biāo)等[1], ANGPTL 4以寡聚體、糖基化及各種亞型的形式存在，經(jīng)細(xì)胞分泌后可直接進(jìn)入血循環(huán)，在糖脂代謝、動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血管發(fā)生、細(xì)胞分化、腎臟損傷等方面具有重要作用[2-3]。

巨噬細(xì)胞可分為2個(gè)亞群，即M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在宿主防御細(xì)菌和病毒感染中發(fā)揮核心作用。M2型巨噬細(xì)胞參與抗炎反應(yīng)、寄生蟲感染、組織重構(gòu)、纖維化以及腫瘤疾病發(fā)展相關(guān)。腫瘤組織相關(guān)的M2型巨噬細(xì)胞主要通過分泌精氨酸酶、IL-10、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及金屬基質(zhì)蛋白酶等促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[4-5]。ANGPTL 4已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌、腎癌及頭頸癌等多種腫瘤的發(fā)病有關(guān)[6-8]。為探討ANGPTL 4是否通過調(diào)控M 2型巨噬細(xì)胞的分化而參與腫瘤免疫逃逸過程，本文利用ANGPTL 4特異性基因敲除小鼠及重組ANGPTL 4蛋白，觀察ANGPTL 4是否具備調(diào)節(jié)M 2型巨噬細(xì)胞分化的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

LPS購(gòu)自Sigma-Aldrich公司, RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。重組ANGPTL 4蛋白來源于(R&D Systems), F4/80抗體(T45-2342)、CD4抗體(RM4-5)購(gòu)自BD公司。CD206抗體(C068C2)、IL-4抗體(11B11)購(gòu)自eBioscience公司。ANGPTL 4-/-鼠自美國(guó)NIH隸屬的突變小鼠資源和研究中心(MMRRC)引進(jìn), C 57BL/6小鼠來自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾臟單細(xì)胞懸液的分離: 分別取8～12周ANGPTL 4-/-小鼠和對(duì)照C 57BL/6小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠，浸泡于75%的酒精，在無(wú)菌操作臺(tái)中提取小鼠脾臟，加入預(yù)冷的無(wú)菌PBS中，研磨小鼠脾臟，去除血漬和外膜，于200目無(wú)菌濾網(wǎng)中過濾小鼠脾臟細(xì)胞，所得濾液移入50 mL離心管中。以4 ℃、1 500 轉(zhuǎn)/min離心5 min, 去除上清，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，吹打均勻，靜置10 min, 加入9 mL PBS終止裂解, 4 ℃、1 500 轉(zhuǎn)/min離心5 min, 去上清，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，進(jìn)行下一步操作。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和分選細(xì)胞: 按1.2.1方法制備脾臟單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按照每個(gè)EP管1×106個(gè)細(xì)胞分管，加PBS至每管100 μL, 按說明書要求劑量加入相應(yīng)的熒光抗體F4/80, 4 ℃避光孵育30 min。加入800 μL PBS洗滌抗體, 4 ℃、1 500轉(zhuǎn)/min離心10 min, 棄上清，用400 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，充分混勻，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分選F4/80+巨噬細(xì)胞。將分選所得F4/80+巨噬細(xì)胞移入胎牛血清封閉的50 mL離心管中保存，進(jìn)行下一步操作。

1.2.3 巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng): 按1.2.2方法分選的巨噬細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，加入LPS(1 μg/mL)刺激48 h, 收集巨噬細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞按1∶2細(xì)胞數(shù)比例加入24孔板中, 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)48 h。

1.2.4 胞內(nèi)染色法檢測(cè)IL-4的分泌: 檢測(cè)前5 h, 將共培養(yǎng)于24孔板中的細(xì)胞，每孔加入2 μL cell stimulation cocktail(500×), 1 h后，加入BFA。4 h后，收集細(xì)胞移入EP管, 4 ℃、1 500轉(zhuǎn)/min離心5 min, 棄上清。1 mL PBS重新洗滌細(xì)胞, 4 ℃、1 500轉(zhuǎn)/min離心5 min, 棄上清，加入50 μL PBS, 以及CD4(0.5 mg/mL)抗體，充分混勻, 4 ℃避光孵育30 min, PBS洗滌，離心棄上清。每管加200 μL IC Fixation Buffer(eBioscience)重懸, 4 ℃避光孵育30～45 min, 每管加入1 mL 1×Permeabilization Buffer洗滌，離心棄上清。加入IL-4(0.2 mg/mL)抗體, 4 ℃避光孵30～45 min, 1 mL 1×Permeabilization Buffer再次洗滌，離心去上清。加入300 μL 1×Permeabilization Buffer重懸，待流式細(xì)胞儀(FACS Calibur)檢測(cè)。

1.2.5 重組ANGPTL 4蛋白刺激巨噬細(xì)胞: 按照1.2.2方法分選巨噬細(xì)胞，按照每孔5×105細(xì)胞數(shù)鋪至24孔板，加入重組ANGPTL 4蛋白(250 ng/mL), 在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞移入EP管, 4 ℃、1 500轉(zhuǎn)/min離心5 min, 棄上清。加入F4/80、CD206(0.5 mg/mL)抗體，充分混勻, 4 ℃避光孵育30 min, PBS洗滌，離心棄上清。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中M2型(F4/80+CD206+)巨噬細(xì)胞的頻率。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析: 不同處理組之間的差異采取ANOVA分析方法，兩組之間的比較采取團(tuán)體T檢驗(yàn)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ANGPTL 4-/-小鼠脾臟M2型巨噬細(xì)胞頻率的檢測(cè)

取8～12周生理狀態(tài)下的ANGPTL 4-/-小鼠和對(duì)照C 57BL/6小鼠，制備小鼠脾臟單細(xì)胞懸液，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中M2型(F4/80+CD206+)巨噬細(xì)胞的頻率。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較, ANGPTL 4-/-小鼠脾臟M2型巨噬細(xì)胞頻率無(wú)明顯變化。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ANGPTL4-/-小鼠和C57BL/6小鼠脾臟M2型巨噬細(xì)胞的頻率

2.2 LPS對(duì)ANGPTL 4-/-小鼠脾臟M2細(xì)胞分化的影響

分離ANGPTL 4-/-小鼠和C57BL/6小鼠脾臟單細(xì)胞懸液，體外培養(yǎng), LPS(1 μg/mL)刺激48 h, 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2型(F4/80+CD206+)巨噬細(xì)胞的頻率。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比, LPS刺激后, ANGPTL 4-/-小鼠脾臟M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)無(wú)明顯差異。見圖2。

圖2 LPS刺激后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞的頻率

2.3 ANGPTL 4-/-小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)Th2細(xì)胞分化的影響

分離ANGPTL 4-/-小鼠和C57BL/6小鼠脾臟巨噬細(xì)胞，體外培養(yǎng), LPS (1 μg/mL)刺激48 h, 將上述LPS刺激的巨噬細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞按照1∶2的效靶比例共培養(yǎng)48 h, 流式細(xì)胞儀胞內(nèi)染色法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞IL-4的分泌。結(jié)果表明, ANGPTL 4-/-小鼠和C 57BL/6小鼠脾臟M2型巨噬細(xì)胞的內(nèi)在活性無(wú)顯著性差異, ANGPTL 4-/-小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)Th2細(xì)胞分化無(wú)明顯影響。見圖3。

圖3 巨噬細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞(1∶2)共培養(yǎng)后檢測(cè)CD4+T細(xì)胞IL-4的分泌

2.4 重組ANGPTL 4蛋白對(duì)M2細(xì)胞分化的影響

取C 57BL/6小鼠脾臟單細(xì)胞懸液，分別加入PBS和重組ANGPTL 4蛋白，用LPS(1 μg/mL)刺激48 h, 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)頻率。結(jié)果顯示，與PBS組相比，加入重組ANGPTL 4蛋白后, M2型巨噬細(xì)胞頻率無(wú)明顯變化(圖4)。分選C 57BL/6小鼠脾臟巨噬細(xì)胞，分別用PBS和重組ANGPTL 4(rANGPTL 4)蛋白處理, LPS(1 μg/mL)刺激48 h, 將巨噬細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞按照1∶2的效靶比例共培養(yǎng)48 h, 利用流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞IL-4的分泌。結(jié)果顯示，與PBS組相比，加入重組ANGPTL 4蛋白后, CD4+T細(xì)胞IL-4分泌無(wú)明顯差異(圖5)。

圖4 rANGPTL4蛋白處理后檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞的頻率

圖5 rANGPTL4蛋白處理后巨噬細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞IL-4的分泌

3 討 論

本研究首先對(duì)生理狀態(tài)下ANGPTL 4-/-小鼠和C 57BL/6小鼠脾臟M2型巨噬細(xì)胞的頻率進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)M2型(F4/80+CD206+)巨噬細(xì)胞頻率無(wú)明顯變化; 經(jīng)LPS刺激，發(fā)現(xiàn)ANGPTL 4-/-小鼠脾臟M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)無(wú)明顯差異; 同時(shí)，對(duì)M2型巨噬細(xì)胞的內(nèi)在活性進(jìn)行了探討，將經(jīng)LPS刺激的ANGPTL 4-/-小鼠巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞IL-4的分泌無(wú)明顯差異，說明ANGPTL 4-/-小鼠脾臟內(nèi)的M2型巨噬細(xì)胞不能誘導(dǎo)Th2分化; 繼而又用重組ANGPTL 4蛋白對(duì)C 57BL/6小鼠脾臟的巨噬細(xì)胞進(jìn)行處理，將小鼠巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)頻率，以及T細(xì)胞IL-4的分泌情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，均無(wú)明顯差異，證實(shí)ANGPTL 4對(duì)M2型巨噬細(xì)胞的分化及其內(nèi)在活性無(wú)關(guān)。

巨噬細(xì)胞分為M1型和M2型，其中M1型細(xì)胞以糖酵解供能為主，而M2型細(xì)胞則主要利用脂肪酸氧化磷酸化供能[9-10]。抑制巨噬細(xì)胞脂肪酸氧化磷酸化反應(yīng)促進(jìn)向M1細(xì)胞分化，如在脂肪組織維持和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用的Trib 1分子，對(duì)M2類巨噬細(xì)胞的分化具有重要影響[11]。ANGPTL 4已經(jīng)被認(rèn)為是能量穩(wěn)態(tài)的各個(gè)方面的中心參與者，可以通過卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)調(diào)節(jié)脂肪分解，而LPL可促進(jìn)血漿富含TG的脂蛋白的清除[12], 從而升高ATP/AMP的比值。有研究[13]表明，通過激活PKC對(duì)ANGPTL 4的誘導(dǎo)可能在氣道重塑和脂質(zhì)體內(nèi)平衡的調(diào)節(jié)中起重要作用。同時(shí), ANGPTL 4可能通過抑制下丘腦AMPK(AMP激活的蛋白激酶)活性作為厭食癥因子[14]。LKB1在T細(xì)胞活化，活力和代謝中起重要作用，并表明LKB 1-AMPK信號(hào)通過調(diào)節(jié)mTOR活性負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞功能[15]。前期，作者研究了ANGPTL 4-/-小鼠中M2型巨噬細(xì)胞表型及其內(nèi)在生物學(xué)活性，以及ANGPTL 4是否影響M2型巨噬細(xì)胞分化。但ANGPTL 4基于哪條途徑影響AMPK的內(nèi)在活性，從而參與糖脂代謝，以及ANGPTL 4是否通過能量代謝調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性的分子機(jī)制，仍有待進(jìn)一步的研究。

ANGPTL 4被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤相關(guān)，如胃癌、腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤等[16]。其纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域相互作用并激活特異性整聯(lián)蛋白以促進(jìn)傷口愈合，調(diào)節(jié)血管通透性，并調(diào)節(jié)ROS(活性氧物質(zhì))水平以促進(jìn)腫瘤發(fā)生[17]。此外, M2型巨噬細(xì)胞的極化在結(jié)腸腫瘤的發(fā)生和骨肉瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[18-21]。作者目前只證實(shí)生理狀態(tài)ANGPTL 4對(duì)M2型巨噬細(xì)胞分化無(wú)影響，但在腫瘤微環(huán)境下, ANGPTL 4是否影響M2型巨噬細(xì)胞分化參與腫瘤免疫逃逸過程，尚待進(jìn)一步研究。本研究證實(shí)血管生成素樣蛋白4(ANGPTL 4)不能調(diào)節(jié)M2型巨噬細(xì)胞的分化。

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