核磁共振定量法測定利培酮含量

郭留城，郝海軍，杜利月

(1.漯河醫(yī)學高等專科學校 藥學系，河南 漯河 462000；2.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 分析測試中心，上海 201203)

隨著高強度磁場技術不斷進步，核磁共振技術越來越多地應用于定量分析領域[4-7]。目前成功應用的核磁共振定量法(qNMR)主要有氫核磁共振定量法(qHNMR)和氟核磁共振定量法(qFNMR)。本研究分別采用qHNMR和qFNMR測定利培酮的含量，并與質量平衡法測定結果進行比較。為利培酮含量測定提供了一種專屬性高、快速、準確的新方法，也為其他原料藥的核磁共振定量分析、質量控制提供新的策略。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

400 MHz AvanceⅢ型核磁共振儀，Topspin 3.2試驗控制及數據處理軟件(瑞士Bruker公司)；U3000型高效液相色譜儀(戴安中國有限公司)；915KFTi-touch型卡氏水分儀(瑞士Metrohm公司)；XP6型分析天平(Mettler Toledo精密儀器有限公司)。

利培酮原料藥(湖北邦盛化工有限公司，批號 20161227、20170104和20170108)；氘代DMSO(DMSO-d6，美國Sigma公司)；馬來酸(批號 190015-201302，中國食品藥品檢定研究院，含量 99.8%)；4-溴-2-氟-乙酰苯胺(TCI Chemicals)；其他試劑均為分析純。

1.2 定量氫核磁共振法

1.2.1測試條件采用zg30脈沖序列，測定溫度為300 K，譜寬(SWH)為8 012 Hz，中心頻率(O1)設置為2 672.03 Hz，采樣時間(AQ)為4.0 s，弛豫時間(D1)為15 s，脈沖寬度(P1)9.54 s，樣品掃描次數(NS) 32次，空掃(DS)為2次。

1.2.2供試品溶液的配制精密稱取利培酮原料藥19.57 mg及馬來酸14.62 mg，加入1 mL的DMSO-d6，輕微加熱溶解、混勻，放至室溫后轉移0.5 mL至5 mm核磁管中。

1.2.3對照品溶液的配制精密稱取馬來酸15.57 mg于10 mL容量瓶中，配成質量濃度為1.557 mg/mL的馬來酸內標溶液。用該內標溶液分別配制質量濃度為1.02、1.58、2.05、2.88、3.92 mg/mL利培酮系列溶液。混勻、溶解后于室溫放置30 min后進行測定。

1.3 定量氟核磁共振法

1.3.1測試條件采用zgfhigqn.2脈沖序列，測定溫度為300 K，譜寬(SW)為 33.204 5 ppm(SWH=12 500.0 Hz)，射頻中心頻率(O1P)-115.9705(O1=-43 662.70 Hz)，弛豫時間(D1) 10 s，采集時間(AQ) 5.24 s，采樣次數(NS)為 16次，空掃(DS)為 4次。

1.3.2供試品溶液的配制精密稱取利培酮原料藥16.62 mg及4-溴-2-氟-乙酰苯胺18.48 mg，加入1 mL的 DMSO-d6，輕微加熱溶解、混勻，放置，30 min后轉移0.5 mL至核磁管中。

1.3.3對照品溶液的配制精密稱取4-溴-2-氟-乙酰苯胺23.66 mg于10 mL容量瓶中，配成質量濃度為2.366 mg/mL的內標溶液。用該內標溶液分別配制質量濃度為1.07、1.68、2.22、3.02、4.06 mg/mL利培酮系列溶液。混勻、溶解后于室溫放置30 min后進行測定。

2 結果與討論

2.1 核磁定性分析結果

1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.98～8.02(m,1H)，7.66～7.68(m,1H)，7.29～7.35(t,1H)，3.70～3.84(t,2H)，3.07～3.18(m,1H)，2.90～3.06(m,2H)，2.65～2.78(m,2H)，2.53～2.61(m,2H)，2.29～2.40(m,2H)，2.09～2.27(m,5H)，1.90～2.07(m,2H)，1.66～1.88(m,6H)。1H NMR譜的低場區(qū)(δ8.02～7.35)顯示了利培酮結構式中的3個芳香氫信號。而高場區(qū)(δ3.84～1.66)共顯示24個質子峰，為利培酮結構式中甲基、亞甲基及次甲基質子信號(部分質子信號發(fā)生重疊)。19F NMR(400 MHz，DMSO-d6)圖譜僅在化學位移δ-109.95處出現一單峰。1H NMR和19F NMR圖譜結果，與利培酮分子式(C23H27FN4O2)基本相符。

2.2 測試參數

確定氫核磁共振定量法和氟核磁共振定量法測試參數時，均采用樣品定量峰與內標峰面積比值穩(wěn)定時的初始值[8]，以節(jié)省測定時間，提高效率。射頻中心頻率(O1P)也會較大地影響測定結果，為保證定量測試結果的準確性，O1P應位于定量峰和內標峰的正中位置，以避免相位校正時帶來的誤差。另外，在配制樣品溶液時一般會進行加熱操作，加熱后的樣品在測試環(huán)境放置一段時間后會在溶液內部出現氣泡。因此，樣品溶液應在測試環(huán)境放置30 min以上再進行測定。

圖1 利培酮與馬來酸混合物的qHNMR譜圖Fig.1 qHNMR spectrum of the mixture of risperidone and maleic acid

2.3 定量氫核磁共振法測定利培酮含量

2.3.1方法學研究按“1.2.1”實驗條件，獲取利培酮與馬來酸混合溶液的1H NMR，并調整相位及基線(見圖1)。預實驗結果顯示，利培酮在δ4.0～7.10范圍內無信號峰，因而選用馬來酸(δ6.02)作為內標物質時，其信號峰與利培酮的信號峰(δ7.29～7.35)可完全分離、互不干擾，且基線平整，專屬性較高。

平行配制6份供試品溶液，分別進樣測定，并計算利培酮的測定結果，測得相對標準偏差(RSD)為1.2%。

取利培酮供試品溶液，分別于0、1、2、4 h進樣測定。以定量峰與內標峰面積比值為參考，計算得RSD為0.72%，表明樣品溶液在測試環(huán)境中4 h內穩(wěn)定。

移取“1.2.3”部分用內標溶液分別配制的質量濃度為1.02、1.58、2.05、2.88、3.92 mg/mL利培酮系列溶液0.5 mL至核磁管中，進樣獲取1H NMR譜。各質量濃度的1H NMR譜經相位校正后，以利培酮定量峰與內標峰峰面積之比(x)為橫坐標，兩者質量濃度比(y)為縱坐標進行線性回歸。得到回歸方程為y=1.935 3x-0.066 7(r=0.999 1)，說明在1.02～3.92 mg/mL范圍內，利培酮質量濃度與其定量峰面積呈線性關系。

取利培酮溶液，逐步進行稀釋。以信噪比(S/N)為10時對應的質量濃度作為定量下限(LOQ)；以(S/N)為3時對應的質量濃度作為檢出限(LOD)[8-9]。結果顯示，采用qHNMR測定利培酮含量時，定量下限為12.34 mg/L,檢出限為3.08 mg/L。

2.3.2含量測定分別精密稱取3批利培酮原料藥，配制進樣溶液，按“1.2.1”測試條件分別進樣測定，按下式計算利培酮含量。得到3批利培酮含量分別為97.31%、97.08%和97.63%。

式中：As為利培酮定量峰的積分面積；ns為利培酮定量峰代表的原子數；Ms為利培酮分子量；ms為利培酮質量；Ar為內標峰的積分面積；nr為內標峰所代表的原子數；Mr為內標分子量；mr為內標質量；Wr為內標的百分含量。

2.4 定量氟核磁共振法測定利培酮含量

圖2 利培酮與4-溴-2-氟-乙酰苯胺混合物的19F NMR圖譜Fig.2 19F NMR spectrum of the mixture of risperidone and 2-bromo-4-fluoroacetanilide

2.4.1方法學考察取供試品溶液，按“1.3.1”條件，獲取利培酮與4-溴-2-氟-乙酰苯胺的19F NMR圖譜(見圖2)。19F NMR圖譜僅有兩個信號峰，其中化學位移δ-109.95和δ-121.71分別為利培酮和內標物4-溴-2-氟-乙酰苯胺的信號峰。圖譜非常直觀，專屬性較高。

取供試品溶液連續(xù)進樣6次，計算定量峰與內標峰面積比值，得RSD為0.34%。

按照“1.3.2”方法，平行配制6份供試品溶液，分別進樣測定利培酮含量，得RSD為0.76%。

取利培酮供試品溶液，分別于0、1、2、4 h進樣測定。以定量峰與內標峰面積比值為參考，計算得RSD為0.47%，表明樣品溶液在測試環(huán)境中4 h內穩(wěn)定。

移取“1.3.3”部分用內標溶液分別配制的質量濃度為1.07、1.68、2.22、3.02、4.06 mg/mL利培酮系列溶液0.5 mL至核磁管中，進樣獲取19F NMR譜。各濃度的19F NMR譜經相位校正后，以利培酮定量峰與4-溴-2-氟-乙酰苯胺峰面積之比(x)為橫坐標，兩者質量濃度比(y)為縱坐標進行線性回歸。得到回歸方程為y=1.105 7x+0.033 7(r=0.999 5)，說明在1.07～4.06 mg/mL范圍內，利培酮質量濃度與定量峰面積呈線性關系。

取利培酮溶液，逐步進行稀釋。以信噪比(S/N)為10時對應的質量濃度作為定量下限(LOQ)；以(S/N)為3時對應的質量濃度作為檢出限(LOD)[8-9]。結果顯示，采用qFNMR測定利培酮含量時，定量下限為14.84 mg/L,檢出限為3.46 mg/L。

2.4.2含量測定分別精密稱取3批利培酮原料藥，按“1.3.2”配制進樣溶液，按“1.3.1”條件分別進樣測定，按“2.3.2”公式計算利培酮含量。測得3批利培酮含量分別為98.18%、98.53%和98.36%。

2.5 質量平衡法定值結果

取3批利培酮原料藥采用HPLC面積歸一化法測定，結果分別為99.84%、99.89%和99.76%；水分測定結果分別為1.14%、1.00%和1.03%；熾灼殘渣分別為0.14%、0.17%和0.14%；3批利培酮殘留溶劑均為0.000 2%。根據質量平衡法計算公式：(100%-水分%-熾灼殘渣%-殘留溶劑%)×HPLC面積歸一化法測定結果(%)。計算得3批原料藥的含量分別為98.56%、98.72%和98.59%。氫核磁共振定量法和氟核磁共振定量法的測定結果與質量平衡法基本一致，其中氟核磁共振定量法更接近質量平衡法。分析其原因為：氫核磁共振定量法一般選擇尖銳的單峰作為定量峰，本研究選擇的定量峰由于受到附近19F原子核耦合裂分的影響，定量峰裂分為多重峰，因而影響了含量測定結果的準確性。

3 結 論

本研究分別對氫核磁共振定量法和氟核磁共振定量法兩種核磁定量技術測定利培酮含量進行了方法學研究，并將測定結果與質量平衡法進行了比較。結果顯示，兩種核磁定量技術的測定結果基本與質量平衡法一致，為利培酮的含量測定及對照品的標定提供了一種新的含量測定方法。雖然qNMR的檢測靈敏度不如HPLC法，但具有快速、簡單、無需對照品等優(yōu)勢。隨著高磁場的應用及傅立葉變換技術的發(fā)展，將進一步推動核磁共振技術在定量分析領域中的應用。

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