分散固相萃取/氣相色譜質譜法測定動物源性食品中的氟蟲腈及其代謝物

王艷麗，陳克云，梁秀清，張紅霞，胡 梅，劉艷明，祝建華

(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101)

氟蟲腈是一種廣譜殺蟲劑，能有效殺死跳蚤、虱子等生物，被世界衛生組織列為“對人類有中度毒性”的化學品。歐盟、美國和中國香港對鮮蛋中氟蟲腈的限量要求分別為0.005、0.03、0.02 mg/kg，其中歐盟規定氟蟲腈不得用于人類食品產業鏈的畜禽養殖過程，且對所有食品的限量要求均為0.005 mg/kg；國際食品法典委員會對蛋類、禽肉類和內臟中氟蟲腈的限量要求分別為0.02、0.01、0.02 mg/kg，但對氟蟲腈代謝物的限量無明確規定。我國自2009年10月1日起禁用氟蟲腈，并在GB2763-2016中明確了氟蟲腈在谷物、蔬菜中的最大殘留限量，但對于蛋類和禽類中的最大殘留限量未做規定。

歐盟爆發雞蛋中氟蟲腈超標的問題，短時間內在國際上引起了廣泛關注。由于產蛋雞食用了含有氟蟲腈成分的飼料，導致雞蛋及其制品、雞肉及其制品存在氟蟲腈殘留的風險。目前國內外對氟蟲腈及其代謝物的檢測方法主要有液相色譜-質譜法[1-5]、氣相色譜法[6-7]、氣相色譜-質譜法[8-15]和氣相色譜-串聯質譜法[16]。有關畜禽肉、蛋及內臟中氟蟲腈及其代謝物(氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚)殘留的同時檢測方法尚無報道。本研究采用氣相色譜-質譜法和氣相色譜-三重四極桿串聯質譜法，對畜禽肉、蛋及內臟中氟蟲腈及其代謝物進行同時測定，保證了定性定量的準確性，能夠滿足國內外對肉、蛋及內臟中氟蟲腈及其代謝物殘留量的檢測要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ8000Evo氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀，配有EI源(美國賽默飛世爾科技公司)；Agilent7890B-5975A氣相色譜-質譜聯用儀，配有CI源、EI源(美國安捷倫公司)；氮吹儀(美國Organomation公司)；高速離心機(德國Sigma)；Milli-Q超純水機；電子分析天平(北京賽多利斯)；正己烷、乙腈(農殘級，德國默克公司)；N-丙基-乙二胺吸附劑(PSA粉末，Agela，40～60 μm)；硅膠(C18，Agela，50 μm，60 ?)；石墨化碳黑(GCB，德國CNW公司)；NaCl(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；氟蟲腈、氟甲腈(MB46513)、氟蟲腈砜(MB46136)、氟蟲腈硫醚(MB45950)標準物質(國家農業部環境保護科學研究檢測所)。

1.2 標準溶液的配制

混合標準溶液：將液體標準物質用丙酮-正己烷(3∶7)稀釋成 10 mg/L 的混合標準儲備液，于4 ℃冰箱內避光保存，有效期為3個月。

基質標準工作溶液：量取一定體積的混合標準溶液，根據需要用陰性樣品提取凈化后的溶液稀釋成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L的系列基質標準工作溶液，現用現配。

1.3 樣品前處理

樣品預處理：樣品經食品粉碎機充分粉碎混勻，制備好的試樣裝入潔凈容器內，于4 ℃冰箱中保存。

提取：稱取5.00 g已粉碎的樣品至50 mL離心管中，加5 mL水，渦旋1 min，再加20 mL乙腈，渦旋2 min，超聲20 min；加4 g氯化鈉，渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min。

凈化：取上清液12 mL至50 mL離心管中，加入10 mL乙腈飽和的正己烷除脂，棄去正己烷層。對于豬肉提取液，加入250 mg PSA和250 mg C18進行凈化；對于雞蛋、雞肉、內臟，加入250 mg PSA、250 mg C18和100 mg GCB凈化。取10 mL凈化液氮吹至近干，1 mL丙酮-正己烷(3∶7)定容，過膜，待測。

1.4 儀器條件

1.4.1氣相色譜條件色譜柱為TR-35MS(30 m×250 μm×0.25 μm，美國Thermo公司)；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度90 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至260 ℃，保持5 min；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL；載氣:高純氦氣(99.999%)，恒定流速：1 mL/min。

1.4.2質譜條件EI源質譜條件：傳輸線溫度:280 ℃，離子源溫度：300 ℃；四極桿溫度：180 ℃；電離能量:70 eV；溶劑延遲：7 min；監測方式：SIM模式。氟蟲腈及其代謝物的選擇離子見表1。

NCI源質譜條件：反應氣為甲烷(純度≥99.99%)，40%流量。離子源和四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度280 ℃；電離能量：70 eV；溶劑延遲：7 min；監測方式：SIM模式。氟蟲腈及其代謝物的選擇離子見表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物的GC-MS質譜信息Table 1 MS information for fipronil and its metabolites

*quantitative ion

三重四極桿串聯質譜條件：電子轟擊離子(EI)源，電離能量為70 eV，離子源溫度為300 ℃；傳輸線溫度為280 ℃；掃描模式為選擇反應監測(SRM)；溶劑延遲時間為7 min。4種待測組分的母離子、特征離子碎片及其碰撞電壓見表2。

表2 氟蟲腈及其代謝物的GC-MS/MS信息Table 2 GC-MS/MS information of fipronil and its metabolites

*quantitative ions

圖1 不同用量PSA與C18凈化的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of different amounts of PSA and C181:50 mg+50 mg；2:100 mg+100 mg；3:250 mg+ 250 mg；4:500 mg+500 mg

2 結果與討論

2.1 樣品前處理的優化

雞蛋、雞肉、雞肝、豬肉和豬腎等樣品含有大量的蛋白質和脂肪，由于乙腈的極性強，能較少地提取脂肪并具有沉淀蛋白的作用，因此選用乙腈作為提取液。PSA和C18混用可有效去除脂肪、碳水化合物等雜質。實驗優化了PSA和C18的用量，通過TIC圖(圖1)比較，發現選用250 mg PSA和250 mg C18時，雜質最少。對于雞蛋、雞肉及內臟等樣品，提取液中需加入適量GCB以凈化色素。實驗比較了不同用量GCB的凈化效果，發現不加GCB時在目標物出峰時間段內雜質峰響應較高；當加入100 mg和200 mg GCB時，雜質峰響應相差不大。另外通過比較目標物的回收率，發現加入不同量的凈化劑時目標物的損失差別不大，因此最終選用250 mg PSA、250 mg C18和100 mg GCB進行凈化。

2.2 儀器條件的優化

由于氟蟲腈及其代謝物含有多個鹵原子，故選擇適用于只對含電負性元素化合物有響應的NCI源進行測定。結果發現，而用NCI源方法得到的雞蛋陰性樣品的譜圖非常干凈；而用EI源得到的譜圖，不論是單極質譜還是串聯質譜，均在目標峰附近出現雜質峰。因此，GC-MS/NCI的選擇性優于GC-MS/EI和GC-MS/MS/EI。

2.3 線性范圍、方法檢出限及定量下限

為消除基質效應對定量結果的影響，實驗采用空白樣品提取液配制基質匹配標準溶液。按“1.3”條件進行測定，混合標準溶液的選擇離子監測圖見圖2。以各組分的定量離子峰面積(Y)為縱坐標，其質量濃度(X，mg/L)為橫坐標繪制標準曲線，得到4種組分的線性方程及相關系數(r2)。在優化色譜條件下，通過空白樣品加標試驗確定方法的檢出限(LOD，S/N=3)和定量下限(LOQ，S/N=10)，結果見表3。結果表明，在0.001～2.0 mg/L范圍內，各目標物呈良好的線性關系。另外，通過比較表3中檢出限和定量下限數據可以看出，NCI的靈敏度最高。

表3 氟蟲腈及其代謝物的線性方程、相關系數、檢出限和定量下限

圖2 混合標準溶液(100 μg/ L)在不同模式下的選擇離子監測圖
Fig.2 SIM chromatograms of standards mixture(100 μg/ L) obtained under the different modes
A.GC-MS/EI-SIM，B.GC-MS/NCI-SIM,C.GC-MS/MS/EI-SIM;1.fipronil desulfinyl；2.fipronil sulfide；3.fipronil；4.fipronil sulfone

2.4 精密度與回收率

稱取不含目標物的雞蛋、雞肝、豬肉、豬腎，分別添加2、50、500 μg/kg 3個濃度水平的氟蟲腈及其代謝物的混合標準溶液，按所建立的方法進行前處理及GC-MS測定。每份樣品平行測定6次，考察方法的回收率和精密度。測得GC-MS/NCI、GC-MS/EI和GC-MS/MS/EI方法的回收率為80.0%～108.0%，相對標準偏差(RSD)為1.1%～7.6%，可見該方法具有較好的可靠性。3種方法的回收率和相對標準偏差見表4～6。

表4 GC-MS/NCI法測定氟蟲腈及其代謝物的平均加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 4 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of fipronil and its metabolites in GC-MS/NCI(n=6)

(續表4)

表5 GC-MS/EI法測定氟蟲腈及其代謝物的平均加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 5 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of fipronil and its metabolites in GC-MS/EI(n=6)

表6 GC-MS/MS/EI法測定氟蟲腈及其代謝物的平均加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 6 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of fipronil and its metabolites in GC-MS/MS/EI(n=6)

2.5 實際樣品的檢測

表7 雞蛋中氟蟲腈砜的測定結果(n=3)Table 7 Analytical results of fipronil sulfone in eggs(n=3)

從市場上隨機購買30份雞蛋、雞肉、豬肉、雞肝、豬腎樣品，利用本方法對樣品中的氟蟲腈及其代謝物進行檢測。有5批雞蛋樣品檢出氟蟲腈砜，檢出值為0.009～0.099 mg/kg。應用所建立的3種方法分別對5批次雞蛋樣品中的氟蟲腈砜含量進行測定和比較，每個樣品平行測定3次，結果見表7，3種方法的測定結果基本一致。圖3為檢出氟蟲腈砜的陽性雞蛋樣品使用3種方法檢測得到的TIC圖。

3 結 論

本文建立了GC-MS/EI、GC-MS/NCI和GC-MS/MS/EI 3種技術測定動物源性食品中氟蟲腈及其代謝物殘留量的檢測方法，并對3種技術的測定結果進行了比較。結果表明，3種方法均簡單快捷，準確度和精密度高，且具有較高的靈敏度，均能滿足國內外對氟蟲腈及其代謝物的限量要求。3種方法均無干擾，但NCI法明顯比EI法靈敏度高。3種方法相互補充確證，可有效提高定性和定量結果的準確性。

參考文獻：

[1] Lin T，Fan J L，Yang D S，Liu X Y，Shao J L，Li Y G，Liu H C.J.Instrum.Anal.(林濤，樊建麟，楊東順，劉興勇，邵金良，李彥剛，劉宏程.分析測試學報)，2015，34(12):1360-1365.

[2] Lü B，Yin S X，Chen D W，Fang C R，Zhou S，Zhao Y F.J.Instrum.Anal.(呂冰，尹帥星，陳達煒，方從容，周爽，趙云峰.分析測試學報)，2017，36(12):1424-1430.

[3] Zhang M Y，Bian K，Zhou T，Song X Q，Liu Q Y，Meng C Y，He L M.J.Chromatogr.B，2016,1014：31-36.

[4] Wu C，Ren H L，Zhao Z Q，Wang L.FujianAnal.Test.(吳成，任海雷，趙志強，王蕾.福建分析測試)，2016，25(5):37-41.

[5] He M，Song D，Dong F S，Zheng Y Q.Environ.Chem.(賀敏，宋丹，董豐收，鄭永權.環境化學)，2016，35(5):925-932.

[6] Chen Z T，Ding L P，Wu W F，Zheng X P，Guo J，Zheng L.Agrochemicals(陳志濤，丁立平，吳文凡，鄭香平，郭菁，鄭鈴.農藥)，2014，53(12):904-905.

[7] Zhou Y，Xu D M，Chen D J，Zhang Z G，Zheng X H，Fang E H.Chin.J.Chromatogr.(周昱，徐敦明，陳達捷，張志剛，鄭向華，方恩華.色譜)，2011，29(7):656-661.

[8] Ye Q，Deng Y C，Liang Y K，Gao Y W，Luo C，Ding H Q.Agrochemicals(葉倩，鄧義才，梁應坤，高毓文，駱沖，丁海權.農藥)，2017，56(3):203-206.

[9] Ramasubramanian T，Paramasivam M，Jayanthi R，Chandrasekaran S.FoodChem.，2014，150(5):408-413.

[10] Paramasivam M，Chandrasekaran S.Int.J.Environ.Anal.Chem.，2013，93(11)：1203-1211.

[11] Chen S S，Ding C，Guo L X，Ma X D，Lin Y.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(陳珊珊，丁丞，郭立新，馬曉東，林燕.質譜學報)，2013，34(5):274-281.

[12] Kaur R，Mandal K，Singh B.J.AOACInt.，2015，98(2):464-466.

[13] Ding L P，Liu W，Fang G W，Guo J，Zheng L，Zhang R，Chen Z T.J.Instrum.Anal.(丁立平，劉微，方光偉，郭菁，鄭鈴，張睿，陳志濤.分析測試學報)，2013，32(8):117-120.

[14] Rong J F，Wei H，Xu M Z，Weng C W，Li Y J，Huang W J.Chin.J.Anal.Lab.(榮杰峰，韋航，許美珠，翁城武，李亦軍，黃煒娟.分析試驗室)，2014，33(1):69-72.

[15] Yan S Y，Li X H，Zhao E C，Jia C H.Chin.J.Anal.Lab.(閆思月，李興海，趙爾成，賈春虹.分析試驗室)，2016，35(4):386-389.

[16] Duhan A，Kumari B，Duhan S.BullEnviron.Contam.Toxicol.，2015，94:260-266.