超高效液相色譜-三重四極桿質譜法測定保健食品中30種非法添加壯陽類化合物

孫 健，胡 青，張 甦，馮 睿，于 泓，張靜嫻，諸艷蓉，毛秀紅，季 申

(上海市食品藥品檢驗所，上海 201203)

隨著生活水平的提高，我國抗疲勞類保健食品市場銷量與日俱增。但少數違法分子為了突出功效、吸引消費者，牟取暴利，在產品中非法添加短期內見效快、成本相對低廉的壯陽類化學藥物。非法添加的壯陽類藥物主要是以西地那非等為代表的磷酸二酯酶5(PDE-5)抑制劑類化合物。目前上市的PDE-5抑制劑主要有西地那非、伐地那非、他達拉非、阿伐那非、烏地那非、米羅那非、歐迪那非[1]。

非法添加該類化合物將給消費者帶來嚴重的健康威脅，其不良反應主要表現在中樞神經、循環和視覺系統，較為嚴重不良反應為心律失常、心肌梗死、心臟猝死、腦血管出血、高血壓等[2]。

該類化合物的檢測多采用高效液相色譜法[3-5]、液相色譜-質譜聯用法等，質譜可采用三重四極桿[6-7]、飛行時間[8-10]、靜電場軌道阱[11]、原位電離[12-14]等技術。其中，飛行時間質譜和靜電場軌道阱質譜為高分辨質譜，可進行定性篩查和未知物結構確證；原位電離技術主要用于快速篩查；三重四極桿質譜定量相對準確，操作簡便，適合基層檢測機構使用。另外，采用近紅外光譜[15]、拉曼光譜[16]、核磁共振法[17]、離子遷移譜法[18]檢測西地那非等1～7種常見壯陽類化合物的研究亦有報道。

目前，我國有4項相關檢測標準。國家藥品補充檢驗方法和檢驗項目批準件2009030、食藥監食監三[2016]28號文附件7和國家食品補充檢驗方法BJS201601[19]均采用液質聯用技術測定了11個化合物(西地那非、他達拉非、伐地那非、紅地那非、那紅地那非、羥基豪莫西地那非、豪莫西地那非、氨基他達拉非、硫代艾地那非、偽伐地那非、那莫西地那非)。由本研究團隊牽頭起草的國家食品補充檢驗方法BJS 201704補充檢測了去甲基他達拉非、硫代西地那非[20-21]。但隨著新型衍生物的不斷出現，如近年來國內報道的化合物丙氧基苯基西地那非(Propoxyphenyl sildenafil)[22]、丙氧基苯基艾地那非(Propoxyphenyl aildenafil)[23]、丙氧基苯基硫代艾地那非(Propoxyphenyl thioaildenafil)、艾地那非、羥基硫代豪莫西地那非[24]、甲羥基豪莫西地那非[25]、2-羥乙基去甲他達拉菲(2-Hydroxyethylnortadalafil)[26]等。因此，上述標準已不能有效打擊此類新型衍生物的違法添加行為，且衍生物多缺乏系統全面的藥理毒理學以及臨床研究，其濫用可能會帶來更嚴重的后果。

多數文獻方法檢測的化合物較少，一般測定10種以下。僅文獻[7]同時測定了17種壯陽類化合物，但化合物種類仍不夠全面，且回收率等方法學驗證未嚴格按照GB/T27404-2008[27]進行。其他檢測20種以上化合物的方法[8,10]均采用高分辨質譜，側重于定性篩查。本文選擇日常監測中發現的易被添加的30種化合物作為檢測指標，建立了超高效液相色譜-三重四極桿質譜法進行測定，該方法定性定量準確，操作簡便，適用于基層檢測機構，可為國家標準的建立提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290/6495超高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀；Waters CORTECS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)。30種對照品的來源及相關信息見表1；乙腈、甲酸(色譜純，Merck公司)；甲醇(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)。

表1 30種化合物的對照品信息Table 1 Information of the 30 reference compounds

(續表1)

1.2 分析條件

色譜柱：Waters CORTECS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為含0.1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～15 min，95%～2%A；15～18 min，2%A；流速：0.3 mL/min，進樣量：1 μL。

離子源：電噴霧離子(ESI)源，正離子模式；離子源溫度：200 ℃；毛細管電壓：4 000 V；干燥氣流量：12 L/min；霧化氣壓力：25 psi；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流量：10 L/min；噴嘴電壓：500 V；采用多反應監測(MRM)方式檢測。30種化合物的母離子、子離子和碰撞能量(CE)見表2。

表2 30種化合物的母離子、子離子、碰撞能量和線性關系Table 2 Precursor ions,product ions，collision energies(CEs) and linearationship of 30 compounds

*quantitative ion

1.3 對照品溶液的制備

分別取30種對照品適量，精密稱定，用甲醇或空白基質提取液溶解并配制成質量濃度分別為10、20、50、100、200 μg/L的系列混合對照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備

1.4.1固體樣品取適量固體樣品，混勻，研細，準確稱取1.0 g粉末，置于具塞試管中，加入10 mL甲醇，密塞，稱重，超聲提取10 min，放冷至室溫后，再次稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，離心，取上清液，根據實際濃度適當稀釋至線性范圍內，作為供試品溶液。

1.4.2液體樣品取適量液體樣品，混勻，準確量取1.0 mL，置于具塞試管中，加入9 mL甲醇，密塞，稱重，超聲提取10 min，放冷至室溫后，再次稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，離心，取上清液，根據實際濃度適當稀釋至線性范圍內，作為供試品溶液。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

因本方法中待測化合物均為正離子模式采集，故在流動相中添加0.1%甲酸，以增加正離子的響應信號。采用梯度洗脫，流動相條件優化后可將豪莫西地那非、艾地那非、丙氧基苯基西地那非和硫代豪莫西地那非、硫代艾地那非兩組同分異構體有效分離。

比較了Waters CORTECS T3(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色譜柱對待測化合物的分離效果及回收率，結果均可滿足分析儀器的要求。考慮到保健食品的基質均較復雜，對色譜柱的使用壽命有一定要求，而后者進行復雜基質檢測時，色譜柱壽命不如前者，故最終選擇Waters CORTECS T3(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)色譜柱對待測化合物進行分離。另外，考慮到保健品基質復雜，強保留成分多，因此待所有組分全部出峰后，采用高比例有機相充分清洗色譜柱，以避免殘留基質對后續樣品的影響。

2.2 質譜條件的優化

30種化合物的電噴霧離子化效果均較好，故采用電噴霧離子化源進行分析。分別用甲醇溶解30種化合物，配制質量濃度為0.5 mg/L的對照品溶液，采用Agilent MassHunter Optimizer軟件自動優化質譜條件，使用單針自動進樣分析目標化合物,在正離子模式下進行全掃描,確定30種化合物的分子離子,將分子離子作為母離子,施加一定的碰撞能量,全掃描二級離子,選取豐度較高的2個子離子分別作為定量和定性離子,以MRM模式優化碰撞能量(V)、碎裂電壓(V)等質譜參數。優化條件下，30種化合物的MRM色譜圖見圖1。

圖1 30種化合物的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 30 compouds

2.3 供試品溶液的制備考察

對比了甲醇和乙腈作為提取溶劑時對30種化合物的提取效果，結果表明乙腈與甲醇的提取結果基本一致，但30種化合物在甲醇中的溶解性較好，綜合考慮成本、試劑毒性等因素，最終確定甲醇為提取試劑。

以保健酒為例對前處理進行研究，比較了Waters Prime HLB固相萃取柱凈化方法(圖2中Method 1)和甲醇直接超聲提取(圖2中Method 2)的實驗效果。結果顯示，HLB固相萃取柱凈化方法的回收率與甲醇直接超聲提取相差不大。因甲醇超聲提取操作簡便，最終確定其為前處理方法。

2.4 基質效應的考察

以保健酒為例考察基質效應，研究顯示，采用溶劑甲醇配制標準曲線時，8種化合物的回收率低于80%，偏差較大，基質效應嚴重。故采用空白基質提取液，配制基質對照品溶液(圖2中Method 3)。結果表明，以空白基質配制標準曲線可使多數化合物的回收率得到明顯改善，僅那紅地那非和紅地那非的回收率低于80%。

圖2 樣品前處理和基質效應的考察Fig.2 Study of sample preparation and matrix effectthe numbers denoted were the same as those in Table 1

2.5 方法學驗證

2.5.1線性關系在上述優化條件下，對系列混合對照品溶液進樣分析，以化合物的峰面積(y)為縱坐標，對應的質量濃度(x，μg/L)為橫坐標進行線性回歸，結果見表2。結果表明，30種化合物在10～200 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數(r)均大于0.99。

2.5.2專屬性選擇牡蠣片和保健酒2種基質作為固態和液態保健食品的代表基質。取牡蠣片和保健酒2種空白基質，按供試品溶液制備方法配制空白溶液，進樣分析，結果均未檢出該30種化合物。

2.5.3加標回收率及精密度取上述2種基質，分別添加低(0.1 mg/kg)、中(0.2 mg/kg)、高(1.0 mg/kg) 3個水平的對照品溶液，每個水平做6個平行樣，按上述供試品溶液制備方法和色譜-質譜條件進行分析，計算加標回收率和相對標準偏差(見表3)。30種化合物的平均加標回收率為62.8%～135.2%，RSD均不大于14%。液體基質中僅那紅地那非和紅地那非的回收率低于80%；固體基質中僅氨基他達拉非的回收率低于80%，硫代艾地那非的回收率大于120%；其余26種化合物的回收率及精密度均符合GB/T 27404-2008(實驗室質量控制規范 食品理化檢測)要求。

表3 30種化合物的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of 30 compounds(n=6)

(續表3)

(續表3)

2.5.4檢出限與定量下限向基質中添加0.05 mg/kg的30種化合物，以能實際檢出的最低含量作為檢出限(LOD)，以回收率符合要求的最低含量作為定量下限(LOQ)。結果表明，30種化合物的LOD為0.05 mg/kg(固體)或0.05 mg/L(液體)，LOQ為0.1 mg/kg(固體)或0.1 mg/L(液體)。

他達拉非、西地那非的臨床用量分別為10 mg/次和50 mg/次。以每次服用保健食品1 g計，起效非法添加的含量分別為10 mg/g和50 mg/g，本方法的檢出限和定量下限可滿足日常非法添加劑量檢測的監管需求。

2.6 定性判斷方法

保健食品中添加的化學藥品為禁用物質，測定方法應首先確保定性準確。本課題組已建立了31種壯陽類化合物的Q-TOF高分辨質譜篩查方法[8]，但受限于基層實驗室儀器、人員等因素，方法推廣不易，且監管方時常需要定量結果。故本研究采用易于標準化操作的三重四極桿質譜建立測定方法，同時兼顧定性定量的準確性。

根據歐盟SANCO/12571/2013的規定，三重四極桿方法確證化合物至少需要兩個子離子，且濃度相當的供試品溶液和標準溶液相對離子豐度一致(相對比例>50%，允許±20%偏差；相對比例>20%～50%，允許±25%偏差；相對比例>10%～20%，允許±30%偏差；相對比例≤10%，允許±50%偏差)。

2.7 實際樣品的測定

表4 實際樣品的檢測結果Table 4 Detection results of real samples

表4列出了保健食品中非法添加化學藥品實際檢測工作中兩百余批涉案專項陽性樣品的檢測結果。結果表明，添加化合物主要為西地那非和他達拉非，亦存在同時添加多種化合物的現象，且含量差異較大，安全風險高。

3 結 論

本研究建立了超高效液相色譜-三重四極桿質譜測定30種壯陽類化合物的分析方法，增加了現有國家標準中檢測化合物的種類，定性定量準確，操作簡便，已應用于實際樣品檢測，可為國家標準的建立提供參考。

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