固相萃取/液相色譜-串聯質譜法測定麥盧卡蜂蜜特征化合物

郭思言，丁 濤，吳 斌，張 峰，馮 峰，劉 蕓，柳 菡，張曉燕，陳 磊，鄧曉軍，伊雄海，楊功俊*，王雪婷

(1.中國藥科大學 藥學院，江蘇 南京 211198；2.江蘇出入境檢驗檢疫局 動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210001；3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 102600；4.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135)

麥盧卡蜂蜜享有新西蘭“國寶”級美譽，是蜜蜂采集當地植物麥盧卡(Leptospermunscoparium)釀成。與一般蜂蜜的抗菌活性不同，其獨特的非過氧化抗菌活性(Non-peroxide antibacterial activity，NPA)[1-2]，可促進傷口愈合[3]、治療足部潰瘍[4-5]等，具有特有的藥用價值[6]。我國的進口蜂蜜中麥盧卡蜂蜜占比越來越大[7]，但目前國內對于麥盧卡蜂蜜的研究較少，這對于進口麥盧卡蜂蜜的監督監管造成了很大影響。麥盧卡蜂蜜根據其抗菌活性高低進行質量評價和分級[8]，不同級別的麥盧卡蜂蜜價格差異巨大。常用丙醛酮(MGO)或二羥基丙酮(DHA)含量評價麥盧卡蜜的級別，但兩者均可人為摻假，非麥盧卡蜂蜜的特征物質受溫度影響較大[9-11]。Kato等[12-13]發現Leoptosperin和丁香酸甲酯是麥盧卡蜂蜜的特征化合物，且其含量與抗菌活性相關。但麥盧卡蜂蜜判定標準缺乏統一，導致蜂蜜市場魚龍混雜。為了建立一種基于科學、準確可靠的麥盧卡蜂蜜鑒定標準，新西蘭初級產業部(Ministry for Primary Industries，MPI)在2017年4月公布了能同時區分出單花種麥盧卡蜜、多花種麥盧卡蜜和非麥盧卡蜂蜜的鑒定標準[14]，最終確定2′-甲氧基苯乙酮(2′-MAP)、2-甲氧基苯甲酸(2-MBA)、3-苯基乳酸(3-PA)和4-羥基苯基乳酸(4-HPA)作為判定麥盧卡蜂蜜的指標。

MPI規定單花種麥盧卡蜜的判定標準為蜂蜜中2′-MAP、2-MBA和4-HPA的含量大于或等于1 mg/kg，3-PA的含量大于或等于400 mg/kg；多花種麥盧卡蜜為2′-MAP、2-MBA和4-HPA的含量大于或等于1 mg/kg，3-PA的含量大于或等于20 mg/kg并且小于400 mg/kg。因特征化合物具有熒光吸收，Jessie等[15]運用高效液相色譜/熒光檢測器對特征化合物進行了檢測，但未能確證。新西蘭官方提供的特征化合物測定方法標準操作程序為“Determination of Four Chemical Characterisation Compounds in Honey by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry(LC-MS/MS),Chemistry Laboratory Method,MPI Technical - Paper No:2017/30”,該SOP于2017年10月4日生效[16]。MPI提供的方法中采用氯吡脲為內標物質，氯吡脲的掃描模式為負離子模式，以其同時作為在正離子掃描模式下待測化合物的內標物缺乏一定科學性。鑒于蜂蜜基質中富含的糖類及一些極性成分會對化合物測定造成干擾，本文對MPI方法進行改良，以便捷安全的SPE結合高靈敏度和準確性的質譜檢測器為分析手段，分別對采集于新西蘭不同產地的麥盧卡蜂蜜、卡奴卡蜂蜜、瑞瓦瑞瓦蜂蜜、卡瑪希蜂蜜、圣誕花蜂蜜、瑞塔蜂蜜、塔瓦瑞蜂蜜等12個品種共114個巢蜜樣本和來自新西蘭、中國、澳大利亞、馬來西亞4個國家的50個商品化蜂蜜進行了驗證。根據蜂蜜品種信息結合鑒定指標要求，對實驗數據結果進行了綜合分析，為麥盧卡蜂蜜判定及單花種和多花種麥盧卡蜂蜜的區分提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

液相色譜-Q trap 4500三重四極桿質譜儀，配ESI源(美國AB SCIEX公司)；Smart-N15VF 超純水系統(中國力康公司)；XW-80A旋渦混合器(上海青浦瀘西儀器廠)；固相萃取裝置(美國Supelco公司)；Oasis HLB固相萃取柱(3 mL，60 mg，美國Waters公司)；0.45 μm尼龍微孔濾膜(天津市津騰實驗設備有限公司)。

2′-甲氧基苯乙酮(純度>97%)、2-甲氧基苯甲酸(純度>98%)、4-羥基苯基乳酸(純度>98%)均購自東京化成工業株式會社；3-苯基乳酸(純度>98%，英國Alfa Aesar公司)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；巢蜜來源于新西蘭各地區，商品蜜購自各大超市。

分別稱取適量2′-MAP、2-MBA和4-HPA標準品用1%甲酸乙腈溶液定容配成1.0 g/L的標準儲備液。稱取適量3-PA標準品配成10.0 g/L的標準儲備液，于冰箱中4 ℃避光貯存；移取各標準儲備液根據需要用乙腈-甲酸-水(體積比10∶1∶90)逐級稀釋成標準工作液，現用現配。

1.2 樣品前處理

稱取1 g(精確至0.01 g)均質蜂蜜樣品至50 mL帶蓋聚四氟乙烯離心管中，用適量1%甲酸水溶液渦旋溶解，轉移溶液至50 mL容量瓶并定容(實際分析時根據蜂蜜中特征化合物含量稀釋至標曲線性范圍內)。準確移取10 mL蜂蜜溶液加入經3 mL甲醇活化以及6 mL水平衡后的Oasis HLB 固相萃取柱，用3 mL水淋洗，2 mL乙腈洗脫，收集洗脫液并用乙腈-甲酸-水(10∶1∶90)定容至10 mL，取1 mL過0.45 μm尼龍微孔濾膜至進樣瓶，上機檢測。

1.3 液質聯用測定條件

1.3.1色譜條件色譜柱：Thermo Hypersil Gold C18(50 mm×2.1 mm，1.9 μm)色譜柱；流動相：A為0.1%(體積分數)甲酸水溶液，B為0.1%(體積分數)甲酸乙腈溶液；流速：0.2 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.75 min，5%B；0.75～2 min，5%～15%B；2～4 min， 15%～70% B；4～6 min，70%～98% B；6～6.5 min，98%B；6.5～7 min， 98%～5%B；7～10 min，5%B。柱溫：(40±2) ℃；進樣體積：2 μL。

1.3.2質譜條件掃描方式：3-PA和4-HPA采用電噴霧負離子掃描模式(ESI-)；2′-MAP和2-MBA采用電噴霧正離子掃描模式(ESI+)；檢測方式：多重反應監測模式(MRM)；正離子：毛細管溫度500 ℃，氣簾氣30 psi，霧化氣50 psi，輔助加熱氣50 psi，離子化電壓5 500 V，入口電壓10 V；負離子：毛細管溫度500 ℃，氣簾氣30 psi，霧化氣50 psi，輔助加熱氣50 psi，離子化電壓-4 500 V，入口電壓-10 V；4種化合物的質譜檢測參數見表 1。

表1 4種特征化合物的質譜檢測參數Table 1 MS/MS parameters of four chemical characteristic compounds

*quantitative ion

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

圖1 4種特征化合物的化學結構式Fig.1 Chemical structures of four characteristic compounds

圖2 不同稀釋溶劑對特征化合物回收率的影響Fig.2 Effect of different diluted solvents on recoveries of characteristic compounds

圖3 4種化合物混合標準溶液的全離子掃描色譜圖Fig.3 Chromatogram of four analytes standard mixtures

蜂蜜基質含有大量糖類及部分強極性組分。糖類在洗脫時易對色譜柱造成損害，其余雜質的存在可對特征化合物的離子化產生不同程度的抑制效應。4種特征化合物均為中等極性(化學結構式如圖1所示)，因此采用親脂的二乙烯基苯和親水的N-乙烯基吡咯烷酮聚合的HLB固相萃取柱對蜂蜜溶液進行凈化，能很好地去除蜂蜜中的大量糖類化合物。

同時分析比較了水、1%甲酸水溶液、10%乙腈-1%甲酸水溶液分別作為稀釋溶劑時，在麥盧卡蜂蜜中加入5 mg/kg的2′-MAP、2-MBA和4-HPA及200 mg/kg的3-PA過柱后的回收率。由圖 2可知，稀釋溶劑為10%乙腈-1%甲酸水溶液時，4-HPA的回收率低于50%，其余3種特征化合物的回收率為50%～70%，稀釋溶劑為1%甲酸水溶液時，特征化合物的平均回收率均較高,因此，選擇1%甲酸水溶液作為稀釋溶劑。

2.2 色譜與質譜條件的優化

比較了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相對4種化合物峰形和保留時間的影響。結果表明，水相中加入適量甲酸有助于化合物峰形對稱，加快出峰時間。有機相使用乙腈可使峰形尖銳，加入適量甲酸則可使兩相混合時，流動相體系的pH值不受梯度洗脫波動，保證出峰時間的穩定。因此，選擇用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

質譜分析采用最為常用的電噴霧電離源(ESI)，分別取1 mg/L的2′-MAP、2-MBA、4-HPA和10 mg/L的 3-PA標準溶液各1 mL采用流動注射泵進樣，分別在正、負兩種掃描模式下對目標化合物進行一級質譜全掃描。優化入口電壓、去簇電壓、碰撞能量等質譜條件參數后，對4種特征化合物分別選取信號強度最強、次強且干擾較少的兩個離子碎片作為定量和定性離子。在優化條件下1 mg/L的2′-MAP、2-MBA、4-HPA和10 mg/L 的3-PA混合標準溶液的總離子流色譜圖見圖3。

2.3 基質效應的評價

考察了空白蜂蜜樣本和含4種特征化合物本底的麥盧卡蜂蜜的加標回收率，結果發現，蜂蜜樣本均存在不同程度的離子化抑制效應，且改變色譜條件也很難降低。MPI方法采用電離方式為ESI-的氯吡脲為內標物質，該化合物并不能對在正離子掃描模式下的化合物進行有效校正。前處理過程中進行固相萃取后發現，特征化合物的回收率明顯提高，為79.4%～98.3%，能滿足分析要求。因此，本實驗采用固相萃取的前處理方法，有效降低了基質效應的影響，提高了方法的準確性。實驗中將未進行固相萃取和固相萃取后的麥盧卡蜂蜜樣品通過高分辨質譜采集m/z100～1 000范圍內的離子，結果顯示，固相萃取能去除強極性糖類化合物，使基質效應明顯下降。

2.4 方法的線性范圍、檢出限與定量下限

配制質量濃度為0.01～1.0 mg/L的2′-MAP、2-MBA、4-HPA 和0.1～10.0 mg/L的3-PA的混合標準溶液，按優化后的方法進樣，以各化合物峰面積(y)為縱坐標，對應的質量濃度(x，mg/L)為橫坐標作線性回歸。結果表明，2′-甲氧基苯乙酮、2-甲氧基苯甲酸和4-羥基苯基乳酸在0.01～1.0 mg/L、3-苯基乳酸在0.1～10.0 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均大于0.99。采用逐級稀釋方式確定方法的檢出限(LODs，S/N≥3)為0.1～1.0 mg/kg，定量下限(LOQs，S/N≥10)為0.5～5.0 mg/kg。

2.5 加標回收率與精密度

在麥盧卡蜂蜜樣品中分別添加2.0、5.0、10 mg/kg 3個水平的2′-MAP、2-MBA、4-HPA和100、200、400 mg/kg的3-PA標準品，每個水平平行測定6次，外標法定量。結果表明，方法的平均回收率為79.4%～98.3%，相對標準偏差(RSD)為3.2%～8.7%(見表2)。麥盧卡蜂蜜中添加10 mg/kg的2′-MAP、2-MBA、4-HPA及200 mg/kg的3-PA標準品的各化合物定量提取離子色譜圖見圖4。

表2 麥盧卡蜂蜜中4種特征化合物的平均加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Average spiked recoveries and RSDs of four characteristic compounds from manuka honey at three different levels(n=6)

表3 不同方法在麥盧卡蜂蜜中4種特征化合物的加標回收率Table 3 Spiked recoveries of four characteristic compounds in manuka honey by different methods

2.6 不同方法測定值的比較

比較了MPI提供的內標方法和采用SPE前處理的外標法在麥盧卡蜂蜜中添加5 mg/kg 2′-MAP、2-MBA、4-HPA及200 mg/kg 3-PA標準品的回收率，結果見表 3。從表3可知，由于MPI選擇的內標物是非同位素內標，結果缺乏一定合理性，內標不能對結果進行有效校正。

2.7 實際樣品的檢測

對來自新西蘭不同產地的麥盧卡蜂蜜、卡奴卡蜂蜜、瑞瓦瑞瓦蜂蜜、卡馬希蜂蜜、圣誕花蜂蜜、瑞塔蜂蜜、塔瓦瑞蜂蜜等共114個蜂蜜樣本和來自新西蘭、澳大利亞、馬來西亞、中國的50個不同商品蜂蜜進行檢測。結果表明，運用該鑒定指標，在新西蘭114個巢蜜樣本中，提供蜜種信息為單花種麥盧卡的55個蜂蜜中只有37個(67.3%)被判定為單花種麥盧卡蜂蜜，8個(14.5%)被判為多花種麥盧卡蜜，10個(18.2%)被判為非麥盧卡蜂蜜；10個蜜種信息為多花種麥盧卡蜂蜜中有8個(80%)被判定為單花種麥盧卡，1個(10%)被判為非麥盧卡蜜；17個卡奴卡蜂蜜中有4個(23.5%)被判為單花種麥盧卡蜜，13個(76.5%)被判為非麥盧卡蜜；而32個非麥盧卡蜜中有1個(3.1%)被判為單花種麥盧卡蜜，5個(15.6%)被判為多花種麥盧卡蜜。在商品化蜂蜜樣本中，標識為單花種麥盧卡蜂蜜的20個樣本中有15個(75%)被判為單花種麥盧卡蜜，3個(15%)被判為多花種麥盧卡蜜，2個(10%)被判為非麥盧卡蜜；2個標識為多花種麥盧卡蜂蜜的有1個(50%)判為單花種麥盧卡蜂蜜，1個(50%)判為多花種麥盧卡蜜；28個標識為非麥盧卡蜜有1個(3.6%)被判為單花種麥盧卡蜂蜜，2個(7.1%)判為多花種麥盧卡蜜。說明判定依據存在誤判性，但能提供一定參考。

3 結 論

建立了固相萃取/液相色譜-串聯質譜(SPE/LC-MS/MS)測定4種麥盧卡蜂蜜特征化合物的分析方法。采用改進的樣品前處理方法及優化的色譜-質譜條件后，可對蜂蜜中4種麥盧卡特征化合物2′-甲氧基苯乙酮、2-甲氧基苯甲酸、3-苯基乳酸和4-羥基苯基乳酸進行準確定性和定量分析。通過對114個巢蜜樣本及50個商品蜜結果進行綜合分析，為判定麥盧卡蜂蜜、區分單花種和多花種麥盧卡蜂蜜提供了一定的參考依據。

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