超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定大鼠血漿中阿帕替尼與紫杉醇

李天雪，胡玉濤*，陳如洋，褚朝森

(1.江蘇聯合職業技術學院 連云港中醫藥分院，江蘇 連云港 222007；2.連云港市藥物研發共性技術中心，江蘇 連云港 222007)

小分子酪氨酸激酶抑制劑阿帕替尼，靶向地作用于血管內皮生長因子受體2(VEGFR-2)，可抑制腫瘤血管生成，從而抑制多種腫瘤細胞的生長，對非小細胞性肺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌和乳腺癌等多種腫瘤有很好的臨床藥理作用[1-4]。紫杉醇是一種四環二萜類細胞毒性抗腫瘤藥，其在腫瘤細胞分裂時能夠與細胞微管蛋白結合，使細胞有絲分裂受到阻礙，進而阻止腫瘤細胞的生長[5- 6]。紫杉醇在臨床上常用于治療卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌以及結腸癌等。相關研究表明，對于惡性腫瘤的治療，單藥治療遠不如聯合用藥的療效顯著，關于阿帕替尼和紫杉醇聯合用藥的臨床研究已有相關報道[7]，因此同時對血漿中這兩種藥物濃度的測定顯得尤為重要。

目前國內外文獻多采用高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)檢測阿帕替尼或紫杉醇的單一血藥濃度[8-12]，鮮有同時測定兩者血藥濃度的研究，且HPLC法檢測的靈敏度并不理想，而HPLC-MS/MS法的檢測時間長。近年來，因快速、精確性高、選擇性強，超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)法在醫藥領域已成為多成分微量分析的首選方法[13-15]，因此，本文采用固相萃取法處理血漿樣品，建立了同時定量測定大鼠血漿中阿帕替尼和紫杉醇的UPLC-MS/MS法，并運用此法對大鼠體內阿帕替尼和紫杉醇的血藥濃度進行了監測。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

安捷倫1290 LC-6460Q三重四極桿串聯質譜儀(美國安捷倫科技公司)，配四元低壓梯度泵和MassHunter B03.01工作站，Eppendorf 5427 R低溫高速離心機(德國Eppendorf有限公司)，Mettler ME155DU 型十萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

對照品阿帕替尼、紫杉醇和內標物(IS)替諾福韋，均由南通經緯生物科技有限公司提供；甲磺酸阿帕替尼片由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供，紫杉醇注射液由深圳萬樂藥業股份有限公司生產；Supelco Discovery DSC-18 固相萃取柱(編號SP10620B，規格1 mL，美國Supelco有限公司)；甲醇(Sigma公司)、乙腈(Merck公司)為色譜純；超純水經過Milli-Q系統純化制備；其余試劑均為分析純，購自國藥集團。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠8只，SPF級，體質量(230±20) g，由南京青龍山動物繁殖場提供，合格證號SCXK(蘇)2017-0001。

1.3 儀器條件

色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相為0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫：0～0.8 min，10%B；0.8～2.5 min，10%～55%B；2.5～5 min，55%～75%B；系統平衡3 min；體積流量0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量3 μL。

質譜采用ESI+源，MRM模式；駐留時間為50 ms；檢測電壓：3.5 kV；離子源溫度：120 ℃；錐孔電壓：220 V；脫溶劑溫度：300 ℃；脫溶劑氣體(N2)體積流量：7 L/min；鞘氣流速：11 L/min；Delta EMV：+200 V。阿帕替尼、紫杉醇和替諾福韋檢測離子的質核比(碰撞電壓)分別為m/z487->372(29 eV)；m/z854.5->286(17 eV)和m/z288->176(25 eV)。

1.4 標準溶液的制備

分別精密稱取阿帕替尼和紫杉醇，以甲醇溶解并定容，配成質量濃度均為0.2 g/L的對照品儲備液；分別取適量對照品儲備液于同一容量瓶中，以甲醇稀釋，配制得系列混合對照品標準工作液。同法用10%甲醇配制內標替諾福韋儲備液(0.2 g/L)，臨用前以10%甲醇稀釋成質量濃度為8 mg/L的IS工作液。上述各對照品溶液于4 ℃下冷藏保存，備用。

1.5 血漿樣品處理

平衡Discovery DSC-18固相萃取柱：先加入2 mL甲醇沖洗，后加入2 mL 0.1%甲酸水淋洗。取血漿樣品100 μL，加入5 μL IS(8 mg/L)，渦旋30 s混勻，取混合溶液裝載進活化后的固相萃取柱，加入1 mL 0.1%甲酸水淋洗小柱，后加入1 mL甲醇-水-甲酸(5∶95∶0.1)淋洗，再加2 mL甲醇-乙腈(90∶10)洗脫，取洗脫液用40 ℃氮氣吹干，加入100 μL 80%甲醇水溶液復溶，渦旋振蕩30 s，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，進樣3 μL分析。

2 結果與討論

2.1 實驗條件考察

2.1.1樣品處理優化實驗考察了液液萃取、固相萃取、蛋白沉淀3種樣品處理方法。結果表明，液液萃取法的選擇性好，但提取回收率的重復性差(RSD為 6.2%～18.4%，n=5)；蛋白沉淀法處理血漿樣品簡單快速，但基質效應明顯；固相萃取法的提取回收率好且基質效應不明顯，因此本文選擇固相萃取法對血漿樣品進行處理。在萃取小柱上，采用0.1%甲酸水溶液淋洗樣品，可促進兩種待測物和蛋白質解離；由于紫杉醇的極性小，預實驗中僅以甲醇洗脫，紫杉醇的提取回收率(R)為78.3%～84.2%，在洗脫液中加入10%乙腈，以增強洗脫力，提高提取回收率，此時紫杉醇的R≥86.2%。

2.1.2流動相優化考察了甲醇、乙腈和水、0.1%甲酸-水、5 mmol/L乙酸銨-水、5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-水構成的流動相系統的分離效果。以甲醇-水/酸水為流動相時兩成分的出峰時間延后，峰形較寬，分離度較差；而乙腈洗脫能力強、粘度小，故選擇乙腈為有機相。在流動相中加入純水會使信號峰出現拖尾和前展的現象；加入乙酸銨提高了質譜離子化效率，但出峰時間較其他體系明顯延后，靈敏度顯著降低；為避免峰拖尾，并增加檢測靈敏度，最終選擇流動相為0.1%甲酸溶液-乙腈。另外，通過調整梯度洗脫條件，可改變被分析物的保留時間，從而使待測物與共流出物分離以減小基質效應，血漿中含大量內源性雜質，設置55%～75%乙腈的梯度，可沖洗色譜柱，抑制連續進樣產生的交叉污染。

圖1 阿帕替尼和紫杉醇的LLOQ(A)和血液樣品(B)的MRM譜圖Fig.1 Typical chromatograms of blank samples spiked with afatinib and paclitaxel at LLOQ(A) and a real sample(B)

2.1.3其他條件優化樣品固相萃取后，使用80%甲醇水溶液復溶，此時進樣體積過大會有較強的基質效應，對進樣體積(2～10 μL)進行優化，當進樣 ≥4 μL時，基質效應誤差超過±15%，進樣2 μL時峰形欠佳且質譜信號響應低于進樣3 μL，故選用3 μL進樣。實驗又考察了Zorbax SB C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)、Zorbax Eclipse Plus C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Zorbax Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm) 3種色譜柱的分離效果，結果表明，柱長對于分析效果至關重要，兩種長度為50 mm柱的駐留時間短(≤1.22 min)、柱壓低，但峰形較寬，靈敏度較低，長度為100 mm柱的峰形對稱且分離度較好。考慮到分離效果比分析速度更重要，選用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)進行后續實驗。考察了柱溫(25、30、35、40、45 ℃)的影響，結果發現，待測物的駐留時間隨柱溫上升而減少，當柱溫高于40 ℃，駐留時間變化不大且高溫會降低色譜柱的使用壽命，故選擇柱溫40 ℃。殘留效應實驗考察了最佳線性范圍的上限，高濃度進樣后立即進樣空白血漿樣品，以空白樣品中測定的峰面積 ≤20%LLOQ的峰面積為殘留合格，同時結合定量方法的推廣實用性，選擇線性關系中最高濃度為1 500 μg/L，殘留效應 ≤15.7%。

2.2 方法學考察

2.2.1專屬性取6份不同來源的空白大鼠血漿，配制加入含對照品的標準血漿樣品后，取大鼠用藥1 h后的血漿，分別進行UPLC-MS/MS分析，記錄質譜圖。空白加標樣品和用藥血漿樣品的典型譜圖見圖1。阿帕替尼和紫杉醇的分離度≥7，血漿中的內源性物質不干擾檢測且峰形良好。

2.2.2線性關系與最低定量下限(LLOQ)分別精密量取系列混合對照品工作液適量，加入100 μL 空白血漿中，制成7個濃度梯度的混合標準血漿樣品，含阿帕替尼和紫杉醇質量濃度均為0.5、1、5、20、100、500、1 500 μg/L。血漿處理后，在優化條件下進行測定，以血漿中化合物的質量濃度(x，μg/L)為橫坐標，被分析物與內標的峰面積比(y)為縱坐標，進行線性回歸(權重因子為1/X2)。以信噪比S/N≥10，相對標準偏差(RSD)≤ 20%，準確度的誤差值在±20%內的最低濃度為LLOQ。結果表明，阿帕替尼和紫杉醇在相應濃度范圍內線性關系良好(r2≥0.998，n=5)，線性方程分別為y=0.054x+0.032 2和y=0.078x+0.006 2，LLOQ均為0.5 μg/L，該UPLC-MS/MS法適用于血漿中阿帕替尼和紫杉醇的微量分析。

2.2.3精密度與準確度按照樣品處理方法配制，用空白大鼠血漿和標準溶液配制低、中、高3個質量濃度QC樣品各5份，連續測定3 d，用線性關系計算相應的濃度，分別考察日內和日間精密度與準確度。阿帕替尼和紫杉醇的3個濃度QC樣品的日內和日間精密度RSD≤8.4%，準確度為92.5%～107.1%，結果均在合格范圍內，表明精密度和準確度良好(表1)。

表1 精密度、準確度、提取回收率及基質效應結果Table 1 The results of the precision,accuracy,extraction recovery and matrix effect

2.2.4稀釋效應配制2 000、5 000 μg/L質量濃度的混合標準血漿樣品各10份，均分為4組，分別用空白血漿稀釋5倍(400、1 000 μg/L)和10倍(200、500 μg/L)，對血漿處理后的稀釋樣品進行分析，計算精密度與準確度以評估稀釋效應。阿帕替尼和紫杉醇血漿樣品經5倍稀釋后，各稀釋樣品的RSD值為0.6%～1.4%，準確度為96.8%～97.8%；10倍稀釋時，RSD值均小于1.5%，準確度為96.5%～98.0%。結果表明，血漿樣品濃度超過標準曲線范圍時，可用空白血漿稀釋后測定相應的濃度。

2.2.5提取回收率與基質效應3個濃度的QC樣品各平行制備5份，記錄峰面積為A。空白血漿處理后添加對照品工作液，制備QC同濃度的溶液，記錄峰面積為B。同質量濃度的對照品工作液，直接分析記錄峰面積為C。則內源性物質引起的基質效應表示為B/C×100%，提取回收率為A/B×100%，結果見表1。由表1可見，其提取回收率為86.2%～95.1%，基質效應在100%±15%范圍內，分析結果滿足阿帕替尼和紫杉醇血漿樣品測定的要求。

2.2.6穩定性取3個濃度的QC血漿樣品各5份，分別于室溫下儲存24 h，4 ℃進樣器中放置12 h，-20 ℃下放置7 d，反復凍融3次(-20 ℃到20 ℃)，采用凍融樣品與新鮮制備的樣品對照獲得準確度，準確度誤差均符合要求(±15%)，結果表明該方法的穩定性良好。

2.3 實際樣品的測定

大鼠適應環境飼養5 d，維持溫度22～25 ℃，濕度55%±10%，實驗前禁食12 h。靜脈注射紫杉醇1.0 mg/kg(5%葡萄糖注射液配液)和灌胃阿帕替尼2.0 mg/kg聯合用藥，分別在給藥前和給藥后0.167、0.33、0.5、0.75、1、1.5、3、8、12、24 h時間點進行大鼠眼眶取血約0.3 mL，血液樣品收集在肝素鈉離心管中，室溫下6 000 r/min離心10 min，制得血漿樣品。按上述UPLC-MS/MS法進樣分析，得阿帕替尼和紫杉醇的血藥濃度～時間曲線(見圖2)。阿帕替尼在(3.00±0.56) h達到ρmax(112.52±24.13) μg/L，AUC0-t值為(1 240.61±240.24) μg·h/L，24 h時濃度仍高于LLOQ，表明在體內的消除率較小；紫杉醇的AUC0-t值為(3 236.77±723.35) μg·h/L。實際樣品測定結果表明，該法可用于大鼠血漿中阿帕替尼和紫杉醇的同時分析。受實驗條件約束，阿帕替尼和紫杉醇在人體的血藥濃度監測實驗仍需進一步研究。

3 結 論

本文首次建立了同時測定大鼠血漿中阿帕替尼和紫杉醇血藥濃度的UPLC-MS/MS方法，該法精確靈敏、選擇性強、專屬性好，對阿帕替尼和紫杉醇的臨床血藥濃度監測及藥動學研究提供了參考，具有分析方法借鑒意義。

參考文獻：

[1] Wang Y S，Fan J，Fu S Z，Ding R L.CancerRes.Prev.Treat.(王永莎，范娟，傅少志，丁瑞麟.腫瘤防治研究)，2016,43(7)：560-565.

[2] Eskens F,Mom C,Planting A,Gietema J,Amelsberg A,Huisman H,Doorn L,Burger H,Stopfer P,Verweij J,Vries E.Br.J.Cancer,2008,98(1):80-85.

[3] Yap T A,Vidal L,Adam J,Stephens P,Spicer J,Shaw H,Ang J,Temple G,Bell S,Shahidi M,Uttenreuther-Fischer M,Stopfer P,Futreal A,Calvert H,Bono J S,Plummer R.J.Clin.Oncol.,2010,28(25):3965-3972.

[4] Freiwald M,Schmid U,Fleury A,Wind S,Stopfer P,Staab A.CancerChemother.Pharmacol.,2014,73(4):759-770.

[5] Ren W W，Mi D H，Li Z，Tian J H，Yang K H，Zhang Z G.Chin.J.CancerPrev.Treat.(任維維，米登海，李征，田金徽，楊克虎，張質鋼.中華腫瘤防治雜志)，2013,20(5)：377-382.

[6] Yang M L，Dong C J，Du X K，Zhao G F，Yu L Z.Chin.Med.Herald(楊明磊，董彩軍，杜學奎，趙國芳，于蓮珍.中國醫藥導報)，2013,10(27)：74-75.

[7] Bertolini F.CancerMetastasisRev.,2008,27(1):95-101.

[8] Stopfer P,Marzin K,Narjes H,Gansser D,Shahidi M,Uttereuther-Fischer M,Ebner T.CancerChemother.Pharmacol.,2012,69(4):1051-1061.

[9] Malhi S,Stesco N,Alrushaid S,Lakowski T M,Davies N M,Gu X C.J.Chromatogr.B,2017,1046(2):165-171.

[10] Li Z Y，Yang X J，Yuan B，Jin Y，Xu H Y.J.ShenyangPharm.Univ.(李志遠，楊曉靜，袁波，金藝，徐海燕.沈陽藥科大學學報)，2013,30(10)：776-781.

[11] Huang X，Tang W W，Jiang Z Z，He M，Zhu Y J，Zhang L Y，Zhang Z J.Chin.J.Pharm.Anal.(黃鑫，湯維維，江振洲，賀明，朱瑤俊，張陸勇，張尊建.藥物分析雜志)，2013,33(11)：1868-1881.

[12] Meng S R，He J H，Pang Y，Jiao J J，Li Q，Gao Y.Chin.J.Pharm.Anal.(孟素蕊，何景華，龐雁，焦建杰，李芹，高洋.藥物分析雜志)，2011,31(6)：1073-1077.

[13] Li T X,Hu L,Zhang M M,Sun J,Qiu Y,Rui J Q,Yang X H.J.Chromatogr.B,2014,944(1):90-100.

[14] Wu R Q，Liang X R，Li W，Liu Y C.J.Instrum.Anal.(吳睿清，梁欣然，李偉，劉玉燦.分析測試學報)，2016,35(11)：1422-1427.

[15] Yang Y，Shi L，Yang J J，Zhang Y Y，Zhang K C.J.Instrum.Anal.(楊媛，石磊，楊軍軍，張瑩瑩，張開春.分析測試學報)，2016,35(12)：1591-1595.