分散固相萃取凈化/高效液相色譜法測定嬰幼兒奶粉與米粉中15種多環芳烴

汪晨霞，張瑞瑞，尋知慶，郭新東，黃金鳳，江藍藍

(廣州質量監督檢測研究院，廣東 廣州 511447)

隨著人們對環境和食品安全的重視，有關PAHs的研究報道越來越多。前處理方法涉及索氏提取法[6]、超聲萃取法[7]、微波萃取法[8]等；測定方法包括氣相色譜-質譜聯用法[6]、氣相色譜-串聯質譜法[9]、高效液相色譜-紫外檢測法[10]和熒光檢測法[11]等。嬰幼兒食品基質較為復雜，并且測定的PAHs組分多、限量低，需要建立提取凈化效果好、檢測靈敏度高的檢測方法。目前已有少量使用氣相色譜-質譜聯用法測定奶粉或米粉的研究[3,12]?；诙喹h芳烴含有大共軛體系的結構特點，本文針對被EPA列為優先控制污染物的16種PAHs，選用分析靈敏度高的高效液相色譜-熒光檢測法，測定了嬰幼兒奶粉和米粉中PAHs的殘留量。由于苊烯的熒光強度低，不適合采用熒光檢測法檢測，因此對其余15種PAHs進行了定性定量分析。檢測方法可滿足限量要求，從而為嬰幼兒食品中多環芳烴殘留量的風險監測[13-14]提供了一定的參考依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Waters 2695，配2489熒光檢測器)(美國Waters公司)；TurboVap LV氮吹儀(美國Caliper公司)；KQ-250DV數控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；ZONKIA KDC-1044離心機(安徽中科中佳公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；JYL-C91T粉碎機(九陽公司)；MS3渦旋儀(德國IKA公司)。

試驗樣品：隨機購買不同品牌的本地市售嬰幼兒奶粉和米粉各10個。

1.2 標準溶液的配制

多環芳烴標準中間液(1 000 μg/L)：吸取多環芳烴混合標準溶液0.25 mL，用乙腈定容至50 mL。

多環芳烴標準工作液：分別吸取一定量的多環芳烴標準中間液用乙腈定容，得到質量濃度為1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/L的系列標準工作溶液。所有標準溶液均保存于4 ℃條件下。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品制備奶粉樣品：取200 g 樣品分裝于密封袋中混合搖勻，室溫保存。

米粉樣品：取200 g樣品經粉碎機粉碎混勻，分裝于密封袋中室溫保存。

1.3.2樣品提取奶粉樣品：稱取1.0 g(精確至0.001 g)樣品加至50 mL離心管中，加5 mL超純水溶解樣品，渦旋均勻，再加入各為0.2 mL的亞鐵氰化鉀(150 g/L)和乙酸鋅(300 g/L)沉淀蛋白，依次加入2 g NaCl、5 mL乙腈渦旋30 s，超聲提取30 min，3 800 r/min離心2 min，取上清液至離心管中；下層殘渣再用乙腈超聲10 min提取2次，合并全部上清液。

米粉樣品：稱取1.0 g(精確至0.001 g)樣品加至50 mL離心管中，加50 mg淀粉酶和5 mL溫水，渦旋均勻，依次加2 g NaCl和5 mL乙腈渦旋30 s，超聲提取30 min，3 800 r/min離心2 min，取上清液至離心管中；下層殘渣再用乙腈超聲10 min提取2次，合并全部上清液。

1.3.3樣品凈化在上清液中加入200 mg PSA，渦旋1 min，3 800 r/min離心2 min，取全部上清液至氮吹管中，氮吹至近干，用乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，過0.22 μm有機系濾膜待測。

1.4 檢測條件

色譜柱：Waters PAH C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；柱溫30 ℃；進樣量為20 μL；流速1.0 mL/min；流動相：A為乙腈，B為超純水，梯度洗脫程序：0～3 min，50%A；3～20 min，50%～100%A；20～25 min，100%A；25～27 min，100%～50%A；27～30 min，50%A。

熒光檢測器：參考文獻[15-16]中一些PAHs的最佳激發及發射波長，結合不同PAHs保留時間的差異，得到熒光檢測程序見表1。

表1 熒光檢測程序Table 1 Fluorescence detection program

圖1 15種多環芳烴標準溶液(20 μg/L)的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 15 PAHs standard(20 μg/L)1.NAP；2.ACP；3.FLU；4.PHE；5.ANT；6.FLT；7.PYR；8.BaA；9.CHR；10.BbF；11.BkF；12.BaP；13.DBA；14.BPE；15.IPY

2 結果與討論

2.1 檢測條件的優化

15種多環芳烴目標物在短時間內用液相色譜分離的難度較大，因此選用多環芳烴專用色譜柱以及梯度洗脫來達到更好的分離效果。通過對柱溫、流速、洗脫條件和熒光檢測程序的優化，得到了最佳的色譜分離及檢測條件。此條件下30 min內所有目標物全部出峰，峰形對稱、分離效果好，均能滿足定性定量的分析要求，標準譜圖見圖1。

2.2 實驗方法的優化

2.2.1樣品提取方式奶粉及米粉樣品基質較為復雜，考慮到多環芳烴為親脂類化合物，而皂化反應可以減少脂類物質帶來的干擾，因此本實驗比較了溶劑直接提取及經50% KOH-甲醇皂化加熱反應后再用溶劑提取兩種前處理方式的效果。結果顯示，溶劑直接提取的回收率優于皂化反應后再提取的方式。并且雖然皂化反應后樣品處理較為完全，但在反應過程中引入了較多的雜質會對目標物的定性定量分析造成干擾。綜上所述，溶劑直接提取方式處理時間短、雜質干擾少，因此采用該方法對樣品進行提取。

圖2 不同提取溶劑的回收率對比Fig.2 Recoveries comparison of different extraction solvents the PAHs numbers denoted were the same as those in Fig.1

2.2.2樣品提取溶劑待測目標物數量較多，綜合考慮PAHs的性質，選用正己烷、甲苯、乙腈3種低、中低、中高極性溶劑進行篩選。結果如圖2所示，采用正己烷和甲苯提取，不同目標物的回收率差異較大(在12.8%～90.6%之間)，而乙腈極性中等偏大，能夠很好兼顧多個目標物的性質，待測物質的提取回收率均達80%以上，能夠滿足檢測要求，因此選擇乙腈為提取溶劑。

圖3 凈化前后加標奶粉樣品的色譜圖(10 μg/L)Fig.3 Chromatograms of spiked sample before and after PSA purification(10 μg/L) the peak numbers denoted were the same as those in Fig.1

2.2.3樣品凈化方法為減少基質效應的影響，采用固相萃取材料對提取液進一步凈化。分別選取分散固相萃取材料PSA、Florisil及HLB固相萃取柱進行凈化，通過比較發現：HLB柱的回收率均不高于50%，Florisil柱凈化后有5種PAHs的回收率低于40%，PSA分散固相萃取后所有目標物的回收率均大于80%。圖3為加標奶粉樣品使用PSA凈化前后的色譜圖，凈化前13號化合物二苯并[a,h]蒽與某雜質的分離不完全，凈化后該雜質大部分被除去。實驗結果表明PSA凈化效果明顯，操作簡單、回收率高，因此選擇PSA分散固相萃取進行凈化。

2.3 線性范圍及檢出限

采用保留時間定性，峰面積外標法進行定量。在最佳檢測條件下，分別測定1.0～50 μg/L的標準工作液，繪制標準曲線。以標準工作液的質量濃度(x)為橫坐標，以被測目標物的峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸計算，得到15種多環芳烴的線性回歸方程，見表2。結果表明，15種多環芳烴在所測濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均大于0.995。

根據1.0 μg/L的標準工作液計算所得的信噪比(S/N)，結合前處理過程，計算得到該方法各目標物的檢出限(LODs，S/N=3)為0.05～0.3 μg/kg(表2)，能夠滿足日常檢測要求。

表2 15種多環芳烴的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限Table 2 Linear equations，linear ranges，correlation coefficients and LODs of 15 PAHs

2.4 方法精密度及回收率

按最優的實驗條件，選取陰性奶粉和米粉樣品進行加標回收，考察方法的回收率及精密度。分別添加1.0、2.0、10 μg/kg 3個水平，每個水平平行測定6次，計算回收率的相對標準偏差(RSD)?；厥章蕿?6.5%～106.8%，相對標準偏差為0.7%～7.5%，結果如表3所示，方法的回收率和精密度均能達到檢測要求。

2.5 實際樣品的測定

在最優實驗條件下測定了市售20種不同品牌的嬰幼兒奶粉和米粉。結果顯示，15種多環芳烴的檢測結果均小于檢出限。

表3 15種多環芳烴的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 15 PAHs(n=6)

3 結 論

本文采用高效液相色譜-熒光檢測法建立了同時測定嬰幼兒奶粉及米粉中作為優先控制污染物的15種多環芳烴的分析方法，并優化了檢測條件、提取方法以及凈化方式。方法學技術指標考察結果表明，本方法的選擇性好、線性范圍寬、精密度高、回收效果好、檢出限低，各項指標均能滿足日常檢測分析要求，適用于嬰幼兒食品中食品污染物多環芳烴的測定，有利于嬰幼兒食品安全日常風險監測工作的開展。

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